വാർത്ത

Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുണ്ട്.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).അതിനിടയിൽ, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് റെൻഡർ ചെയ്യും.
സജീവമാക്കിയ എസ്റ്ററുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ഫിനോക്സി റാഡിക്കലുകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള എൻസൈമാറ്റിക് പ്രോക്‌സിമിറ്റി ലേബലിംഗ് രീതികൾ ജീവകോശങ്ങളിലെ ഉപസെല്ലുലാർ പ്രോട്ടിയോമുകളും പ്രോട്ടീൻ ഇന്ററാക്‌ടറുകളും മാപ്പ് ചെയ്യുന്നതിന് വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, സജീവമാക്കിയ എസ്റ്ററുകൾ റിയാക്ടീവ് കുറവാണ്, തൽഫലമായി വിശാലമായ ലേബലിംഗ് റേഡിയസ് ഉണ്ടാകുന്നു, കൂടാതെ പെറോക്സൈഡ് ചികിത്സയിലൂടെ ഉൽപാദിപ്പിക്കുന്ന ഫിനോക്സി റാഡിക്കലുകൾ റെഡോക്സ് പാതകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തും.മിനിഎസ്ഒജി ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസർ പ്രോട്ടീനിനെ താൽപ്പര്യമുള്ള ഒരു പ്രോട്ടീനുമായി ജനിതകമായി ബന്ധിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് വികസിപ്പിച്ച പ്രോക്‌സിമിറ്റി ലേബലിംഗ് ആശ്രിത ഫോട്ടോ ആക്റ്റിവേഷൻ (പിഡിപിഎൽ) രീതി ഞങ്ങൾ ഇവിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു.നീല വെളിച്ചത്താൽ പ്രചോദിപ്പിക്കപ്പെടുകയും എക്‌സ്‌പോഷർ സമയത്താൽ നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നു, സിംഗിൾ ഓക്‌സിജൻ ഉത്പാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു, തുടർന്ന് അനിലിൻ പ്രോബ് വഴി ഹിസ്‌റ്റിഡിൻ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ സ്‌പേഷ്യോ ടെംപോറൽ പരിഹരിച്ച ലേബൽ നേടുന്നു.ഓർഗനെൽ-നിർദ്ദിഷ്‌ട പ്രോട്ടോം മാപ്പിംഗിലൂടെ ഞങ്ങൾ അതിന്റെ ഉയർന്ന വിശ്വസ്തത പ്രകടമാക്കുന്നു.PDPL-നെ TurboID-യുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുന്നത് PDPL-ന്റെ കൂടുതൽ വ്യക്തവും സമഗ്രവുമായ പ്രോട്ടോമിക് കവറേജ് കാണിക്കുന്നു.അടുത്തതായി, രോഗവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്‌ഷണൽ കോ ആക്‌റ്റിവേറ്റർ BRD4, E3 പാർക്കിൻ ലിഗേസ് എന്നിവയിൽ ഞങ്ങൾ PDPL പ്രയോഗിക്കുകയും മുമ്പ് അറിയപ്പെടാത്ത ഇന്ററാക്‌ടറുകൾ കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്തു.ഓവർ എക്‌സ്‌പ്രഷൻ സ്‌ക്രീനിംഗ് വഴി, രണ്ട് അജ്ഞാത സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളായ Ssu72, SNW1 എന്നിവ പാർക്കിന് വേണ്ടി തിരിച്ചറിഞ്ഞു, അതിന്റെ ഡീഗ്രേഡേഷൻ സർവ്വവ്യാപി-പ്രോട്ടീസോം പാത്ത്‌വേ വഴി മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നു.
പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്കുകളുടെ കൃത്യമായ സ്വഭാവം പല അടിസ്ഥാന സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകൾക്കും അടിവരയിടുന്നു.അതിനാൽ, പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളുടെ വളരെ കൃത്യമായ സ്പേഷ്യോ ടെമ്പോറൽ മാപ്പിംഗ്, ജീവശാസ്ത്രപരമായ പാതകൾ, രോഗ പാത്തോളജി, ചികിത്സാ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി ഈ ഇടപെടലുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള ഒരു തന്മാത്രാ അടിസ്ഥാനം നൽകും.ഇതിനായി, ജീവനുള്ള കോശങ്ങളിലോ ടിഷ്യൂകളിലോ ഉള്ള താൽക്കാലിക ഇടപെടലുകൾ കണ്ടുപിടിക്കാൻ കഴിവുള്ള രീതികൾ വളരെ അഭികാമ്യമാണ്.അഫിനിറ്റി പ്യൂരിഫിക്കേഷൻ മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (AP-MS) ചരിത്രപരമായി താൽപ്പര്യമുള്ള പ്രോട്ടീനുകളുടെ (POIs) ബൈൻഡിംഗ് പങ്കാളികളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഉപയോഗിച്ചു.ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പ്രോട്ടിയോമിക്‌സ് രീതികളുടെ വികാസത്തോടെ, AP-MS അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്കുകളുടെ ഏറ്റവും വലിയ ഡാറ്റാബേസായ Bioplex3.0 സൃഷ്ടിക്കപ്പെട്ടു.AP-MS വളരെ ശക്തമാണെങ്കിലും, വർക്ക്ഫ്ലോയിലെ സെൽ ലിസിസും നേർപ്പിക്കുന്ന ഘട്ടങ്ങളും ദുർബലവും ക്ഷണികവുമായ ബൈൻഡിംഗ് ഇടപെടലുകളോട് പക്ഷപാതം കാണിക്കുകയും ലിസിസിന് മുമ്പുള്ള കമ്പാർട്ട്മെന്റലൈസേഷൻ ഇല്ലാത്ത വ്യാജ ഇന്ററാക്ഷൻ ജോഡികൾ പോലുള്ള പോസ്റ്റ്-ലിസിസ് ആർട്ടിഫാക്റ്റുകൾ അവതരിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.
ഈ പ്രശ്‌നങ്ങൾ പരിഹരിക്കുന്നതിനായി, ക്രോസ്‌ലിങ്കിംഗ് ഗ്രൂപ്പുകളുള്ള പ്രകൃതിവിരുദ്ധ അമിനോ ആസിഡുകളും (UAA) എൻസൈമാറ്റിക് സമീപത്തെ ലേബലിംഗ് (PL) പ്ലാറ്റ്‌ഫോമുകളും (ഉദാ: APEX, BioID)5 വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്.യു‌എ‌എ രീതി പല സാഹചര്യങ്ങളിലും വിജയകരമായി പ്രയോഗിക്കുകയും നേരിട്ട് പ്രോട്ടീൻ പശകളെക്കുറിച്ചുള്ള വിവരങ്ങൾ നൽകുകയും ചെയ്യുന്നുണ്ടെങ്കിലും, യു‌എ‌എ ഉൾപ്പെടുത്തൽ സൈറ്റിന്റെ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ ഇപ്പോഴും ആവശ്യമാണ്.അതിലും പ്രധാനമായി, ലേബലിംഗ് ഇവന്റുകളുടെ ഒരു ഉത്തേജക വിപരീതമല്ലാത്ത ഒരു സ്റ്റോയ്ചിയോമെട്രിക് ലേബലിംഗ് രീതിയാണ് ഇത്.ഇതിനു വിപരീതമായി, ബയോഐഡി രീതി പോലെയുള്ള എൻസൈമാറ്റിക് PL രീതികൾ, എഞ്ചിനീയറിംഗ് ബയോട്ടിൻ ലിഗേസിനെ POI7-ലേക്ക് സംയോജിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് പിന്നീട് ബയോട്ടിൻ സജീവമാക്കി ഒരു റിയാക്ടീവ് ബയോട്ടിനൈൽ-AMP ഈസ്റ്റർ ഇന്റർമീഡിയറ്റ് രൂപീകരിക്കുന്നു.അങ്ങനെ എൻസൈം പ്രോക്സിമൽ ലൈസിൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ലേബൽ ചെയ്യുന്ന ഒരു സജീവമായ ബയോട്ടിൻ "ക്ലൗഡ്" ഉത്തേജിപ്പിക്കുകയും പുറത്തുവിടുകയും ചെയ്യുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, മതിയായ ലേബൽ ചെയ്ത സിഗ്നൽ ലഭിക്കുന്നതിന് ബയോഐഡിക്ക് 12 മണിക്കൂറിൽ കൂടുതൽ ആവശ്യമാണ്, ഇത് താൽക്കാലിക റെസല്യൂഷനോടുകൂടിയ അതിന്റെ ഉപയോഗത്തെ തടയുന്നു.യീസ്റ്റ് ഡിസ്‌പ്ലേയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഡയറക്‌റ്റ് പരിണാമം ഉപയോഗിച്ച്, കൂടുതൽ കാര്യക്ഷമമാക്കാൻ ബയോഐഡിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ് ടർബോഐഡി രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തത്, 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ബയോട്ടിൻ ഉപയോഗിച്ച് കാര്യക്ഷമമായ ലേബലിംഗ് അനുവദിക്കുന്നു, കൂടുതൽ ചലനാത്മക പ്രക്രിയകൾ പഠിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു.TurboID വളരെ സജീവമായതിനാലും എൻഡോജെനസ് ബയോട്ടിൻ ലെവലുകൾ ലോ-ലെവൽ ലേബലിംഗിന് പര്യാപ്തമായതിനാലും, എക്സോജനസ് ബയോട്ടിൻ ചേർക്കുന്നതിലൂടെ വളരെ മെച്ചപ്പെടുത്തിയതും സമയബന്ധിതവുമായ ലേബലിംഗ് ആവശ്യമായി വരുമ്പോൾ പശ്ചാത്തല ലേബലിംഗ് ഒരു പ്രശ്നമായി മാറുന്നു.കൂടാതെ, സജീവമാക്കിയ എസ്റ്ററുകൾ മോശമായി പ്രതിപ്രവർത്തനം നടത്തുന്നവയാണ് (t1/2 ~5 മിനിറ്റ്), ഇത് ഒരു വലിയ ലേബലിംഗ് റേഡിയസിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം, പ്രത്യേകിച്ച് ബയോട്ടിൻ 5 ഉള്ള അയൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ സാച്ചുറേഷൻ ശേഷം. മറ്റൊരു സമീപനത്തിൽ, എഞ്ചിനീയറിംഗ് അസ്കോർബേറ്റ് പെറോക്സിഡേസിന്റെ (അതായത് biotin- ഫിനോൾ റാഡിക്കലുകളും ഒരു മിനിറ്റിനുള്ളിൽ പ്രോട്ടീൻ ലേബൽ ചെയ്യാൻ അനുവദിക്കുന്നു9,10. ഉപസെല്ലുലാർ പ്രോട്ടീമുകൾ, മെംബ്രൻ പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകൾ, സൈറ്റോസോളിക് സിഗ്നലിംഗ് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകൾ എന്നിവ തിരിച്ചറിയാൻ APEX വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകൾ.
അതിനാൽ, സെല്ലുലാർ പാതകളെ കാര്യമായി തടസ്സപ്പെടുത്താതെ, ഉയർന്ന സ്പേഷ്യൽ, ടെമ്പറൽ കൃത്യതയോടെ കൂടുതൽ റിയാക്ടീവ് ലേബൽ ചെയ്ത-റേഡിയസ് സപ്രഷൻ സ്പീഷീസുകളെ സൃഷ്ടിക്കാൻ കഴിവുള്ള ഒരു പുതിയ രീതി നിലവിലുള്ള രീതികൾക്ക് ഒരു പ്രധാന കൂട്ടിച്ചേർക്കലായിരിക്കും. റിയാക്ടീവ് സ്പീഷിസുകളിൽ, സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ അതിന്റെ ഹ്രസ്വമായ ആയുസ്സും പരിമിതമായ വ്യാപന ആരവും (കോശങ്ങളിൽ t1/2 <0.6 µs) കാരണം നമ്മുടെ ശ്രദ്ധ ഉണർത്തി. റിയാക്ടീവ് സ്പീഷിസുകളിൽ, സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ അതിന്റെ ഹ്രസ്വമായ ആയുസ്സും പരിമിതമായ വ്യാപന ആരവും (കോശങ്ങളിൽ t1/2 <0.6 µs) കാരണം നമ്മുടെ ശ്രദ്ധ ഉണർത്തി. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. സജീവമായ രൂപങ്ങളിൽ, സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ നമ്മുടെ ശ്രദ്ധ ആകർഷിച്ചത് അതിന്റെ ഹ്രസ്വമായ ആയുസ്സും പരിമിതമായ വ്യാപന ആരവും (സെല്ലുകളിൽ t1/2 <0.6 µs)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限㼈细胞中t1/2 <0.6 µs 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). സജീവമായ രൂപങ്ങളിൽ, സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ നമ്മുടെ ശ്രദ്ധ ആകർഷിക്കുന്നു, കാരണം അതിന്റെ ചെറിയ ആയുസ്സും പരിമിതമായ വ്യാപന ആരവും (കോശങ്ങളിൽ t1/2 <0.6 μs).സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ മെഥിയോണിൻ, ടൈറോസിൻ, ഹിസ്റ്റിഡിൻ, ട്രിപ്റ്റോഫാൻ എന്നിവയെ ക്രമരഹിതമായി ഓക്സിഡൈസ് ചെയ്യുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, ഇത് അമിൻ അല്ലെങ്കിൽ തയോൾ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള പ്രോബുകൾ 16,17 എന്നിവയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് 14,15 ധ്രുവമാക്കുന്നു.സബ്സെല്ലുലാർ കമ്പാർട്ട്മെന്റ് ആർഎൻഎ ലേബൽ ചെയ്യാൻ സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ ഉപയോഗിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, എൻഡോജെനസ് POI പ്രോക്സിമിറ്റി മാർക്കറുകൾ പുനർനിർമ്മിക്കുന്നതിനുള്ള തന്ത്രങ്ങൾ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യപ്പെടാതെ തുടരുന്നു.ഇവിടെ, ഫോട്ടോ ആക്റ്റിവേഷൻ-ആശ്രിത പ്രോക്‌സിമിറ്റി ലേബലിംഗ് (PDPL) എന്ന ഒരു പ്ലാറ്റ്‌ഫോം ഞങ്ങൾ അവതരിപ്പിക്കുന്നു, അവിടെ ഞങ്ങൾ ഒരു മിനിSOG ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറുമായി സംയോജിപ്പിച്ച POI- കൾ പ്രകാശിപ്പിക്കുന്നതിനും പ്രോക്‌സിമൽ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഓക്‌സിഡൈസ് ചെയ്യുന്നതിനായി സിംഗിൾ ഓക്‌സിജൻ ഉൽപ്പാദനം ട്രിഗർ ചെയ്യുന്നതിനും നീല വെളിച്ചം ഉപയോഗിക്കുന്നു, തുടർന്ന് രാസ പേടകങ്ങളെ ഓക്‌സിഡൈസ് ചെയ്യുന്നതിനുള്ള അമിൻ അടങ്ങിയ പരിഷ്‌ക്കരണങ്ങൾ. ഇന്റർമീഡിയറ്റ് ജീവനുള്ള കോശങ്ങൾ..ടാഗ് സ്പെസിഫിസിറ്റി പരമാവധിയാക്കാൻ ഞങ്ങൾ ഒരു കൂട്ടം കെമിക്കൽ പ്രോബുകൾ പരീക്ഷിക്കുകയും ഓപ്പൺ പ്രോട്ടിയോമിക്സ് വർക്ക്ഫ്ലോ ഉപയോഗിച്ച് മോഡിഫിക്കേഷൻ സൈറ്റുകൾ തിരിച്ചറിയുകയും ചെയ്തു.PDPL-നെ TurboID-യുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുന്നത് PDPL-ന്റെ കൂടുതൽ വ്യക്തവും സമഗ്രവുമായ പ്രോട്ടോമിക് കവറേജ് കാണിക്കുന്നു.ക്യാൻസറുമായി ബന്ധപ്പെട്ട എപിജെനെറ്റിക് റെഗുലേറ്ററി പ്രോട്ടീൻ BRD4, പാർക്കിൻസൺസ് രോഗവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട E3 ലിഗേസ് പാർക്കിൻ എന്നിവയ്‌ക്കായുള്ള ബൈൻഡിംഗ് പാർട്‌ണർമാരുടെ സബ്‌സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടിയോമിന്റെ ഓർഗനെൽ-നിർദ്ദിഷ്ട മാർക്കറുകൾക്കും പൊതുവായ പ്രോട്ടീം തിരിച്ചറിയലിനും ഞങ്ങൾ ഈ സമീപനം പ്രയോഗിച്ചു. ഇടപെടലുകൾ..വലിയ പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളിൽ E3 സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളെ തിരിച്ചറിയാനുള്ള PDPL-ന്റെ കഴിവ് പരോക്ഷ ബൈൻഡറുകളുടെ തിരിച്ചറിയൽ ആവശ്യമായ ഒരു സാഹചര്യത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.സർവ്വവ്യാപി-പ്രോട്ടീസോമിന്റെ മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള രണ്ട് അജ്ഞാത പാർക്കിൻ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകൾ സിറ്റുവിൽ സ്ഥിരീകരിച്ചു.
ഫോട്ടോഡൈനാമിക് തെറാപ്പി (PDT) 19, ക്രോമോഫോർ-അസിസ്റ്റഡ് ലേസർ ഇൻ ആക്ടിവേഷൻ (CALI)20, ഇതിൽ ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറുകൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ലൈറ്റ് റേഡിയേഷൻ സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് ടാർഗെറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളെ നിർജ്ജീവമാക്കാം അല്ലെങ്കിൽ കോശങ്ങളുടെ മരണത്തിന് കാരണമാകും.70 nm സൈദ്ധാന്തിക വ്യാപന ദൂരമുള്ള സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ വളരെ റിയാക്ടീവ് പദാർത്ഥമായതിനാൽ, ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറിന് ചുറ്റുമുള്ള സ്ഥലപരമായി പരിമിതമായ ഓക്സിഡേഷൻ നിയന്ത്രിക്കാനാകും.ഈ ആശയത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, ജീവനുള്ള കോശങ്ങളിലെ പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളുടെ അടുത്ത ലേബൽ നേടുന്നതിന് സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ തീരുമാനിച്ചു.നാല് പ്രവർത്തനങ്ങൾ നിറവേറ്റുന്നതിനായി ഞങ്ങൾ ഒരു PDPL കീമോപ്രോട്ടോമിക് സമീപനം വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്: (1) PL എൻസൈമാറ്റിക് സമീപനത്തിന് സമാനമായ സജീവമായ സിംഗിൾ ഓക്സിജന്റെ ഉത്പാദനം ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതിന്;(2) ലൈറ്റ് ഇനീഷ്യനിൽ സമയപരിഹരിച്ച ലേബലിംഗ് നൽകുക;(3) മാറ്റത്തിലൂടെ (4) പശ്ചാത്തലം കുറയ്ക്കുന്നതിന് എൻഡോജെനസ് കോഫാക്ടറുകൾ (ബയോട്ടിൻ പോലുള്ളവ) ഉപയോഗിക്കുന്നത് ഒഴിവാക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ പാരിസ്ഥിതിക സമ്മർദ്ദത്തിലേക്കുള്ള സെൽ എക്സ്പോഷർ കുറയ്ക്കുന്നതിന് വളരെ അസ്വസ്ഥതയുള്ള എക്സോജനസ് റിയാഗന്റുകൾ (പെറോക്സൈഡുകൾ പോലുള്ളവ) ഉപയോഗിക്കുക.
ചെറിയ തന്മാത്രാ ഭാരം ഫ്ലൂറോഫോറുകൾ (ഉദാ. റോസ് ബംഗാൾ, മെത്തിലീൻ നീല) 22, ജനിതകമായി എൻകോഡ് ചെയ്ത ചെറിയ പ്രോട്ടീനുകൾ (ഉദാ. മിനിഎസ്ഒജി, കില്ലർറെഡ്) 23 എന്നിങ്ങനെ ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറുകളെ രണ്ടായി തിരിക്കാം.ഒരു മോഡുലാർ ഡിസൈൻ നേടുന്നതിന്, POI24,25 (ചിത്രം 1a) ലേക്ക് ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസർ (PS) പ്രോട്ടീനുകൾ ചേർത്ത് ഞങ്ങൾ ഒന്നാം തലമുറ PDPL പ്ലാറ്റ്ഫോം വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു.നീല വെളിച്ചം ഉപയോഗിച്ച് വികിരണം ചെയ്യുമ്പോൾ, സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ പ്രോക്സിമൽ ന്യൂക്ലിയോഫിലിക് അമിനോ ആസിഡ് അവശിഷ്ടങ്ങളെ ഓക്സിഡൈസ് ചെയ്യുന്നു, ഇത് ഇലക്ട്രോഫിലിക് ആയ ഒരു ഉംപോളംഗ് ധ്രുവത്തിന് കാരണമാകുന്നു, കൂടാതെ അമിൻ പ്രോബ് ന്യൂക്ലിയോഫൈലുകളുമായി കൂടുതൽ പ്രതികരിക്കാൻ കഴിയും.ക്ലിക്ക് കെമിസ്ട്രി അനുവദിക്കുന്നതിനും LC/MS/MS സ്വഭാവസവിശേഷതകൾക്കായി താഴേക്ക് വലിക്കുന്നതിനും ഒരു ആൽക്കൈൻ ഹാൻഡിൽ ഉപയോഗിച്ചാണ് അന്വേഷണം രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരിക്കുന്നത്.
miniSOG മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളുടെ ലേബലിംഗിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ചിത്രീകരണം.നീല വെളിച്ചത്തിന് വിധേയമാകുമ്പോൾ, miniSOG-POI പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കോശങ്ങൾ സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് സംവദിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളെ പരിഷ്ക്കരിക്കുന്നു, എന്നാൽ നോൺ-ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളല്ല.ഫോട്ടോഓക്‌സിഡേഷന്റെ ഇന്റർമീഡിയറ്റ് ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ അമിൻ കെമിക്കൽ പ്രോബിന്റെ റിലേ ലേബലുകൾ ഉപയോഗിച്ച് കോവാലന്റ് അഡക്‌റ്റുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നു.കെമിസ്ട്രി പ്രോബിലെ ആൽക്കൈനൈൽ ഗ്രൂപ്പ്, LC-MS/MS ക്വാണ്ടിറ്റേഷനും, പുൾ-ഡൌൺ വഴിയും സമ്പുഷ്ടമാക്കാൻ ക്ലിക്ക് കെമിസ്ട്രിയെ അനുവദിക്കുന്നു.b അമിൻ പേടകങ്ങളുടെ രാസഘടന 1-4.സി പ്രോബ്സ് 1-4 ഉപയോഗിച്ച് മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ലോക്കലൈസ്ഡ് മിനിഎസ്ഒജി-മെഡിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടിയോമിക് മാർക്കറുകളുടെ പ്രതിനിധി ഫ്ലൂറസെന്റ് ജെൽ വിശകലനവും ജെൽ ഡെൻസിറ്റോമെട്രിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ആപേക്ഷിക അളവും.കെമിക്കൽ പ്രോബുകളുടെ സിഗ്നൽ-ടു-പശ്ചാത്തല അനുപാതം നീല വെളിച്ചം ഒഴികെയുള്ള നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണ പരീക്ഷണങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചോ മിനിസോഗ് എക്സ്പ്രഷൻ ഇല്ലാതെ HEK293T സെല്ലുകൾ ഉപയോഗിച്ചോ വിലയിരുത്തി.n = 2 ജൈവശാസ്ത്രപരമായി സ്വതന്ത്ര സാമ്പിളുകൾ.ഓരോ ഡോട്ടും ഒരു ബയോളജിക്കൽ റെപ്ലിക്കയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.d സി പോലെയുള്ള PDPL ഘടകങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യത്തിലോ അഭാവത്തിലോ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത പ്രോബ് 3 ഉപയോഗിച്ച് PDPL-ന്റെ പ്രതിനിധി കണ്ടെത്തലും അളവും.n = 3 ജൈവശാസ്ത്രപരമായി സ്വതന്ത്ര സാമ്പിളുകൾ.ഓരോ ഡോട്ടും ഒരു ബയോളജിക്കൽ റെപ്ലിക്കയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.മധ്യരേഖകളും വിസ്‌കറുകളും ശരാശരിയും ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.CBB: കൂമാസ്സി ബ്രില്യന്റ് ബ്ലൂ.e ഫാർ-റെഡ് Si-DMA സ്റ്റെയിൻ ഉള്ള സിംഗിൾറ്റ് ഓക്സിജന്റെ കോൺഫോക്കൽ ഇമേജിംഗ്.സ്കെയിൽ ബാർ: 10 µm.ജെൽ ഇമേജിംഗും കൺഫോക്കൽ പരീക്ഷണങ്ങളും സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ രണ്ട് തവണയെങ്കിലും സ്വതന്ത്രമായി ആവർത്തിച്ചു.
HEK293T-ൽ സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന, മുതിർന്ന ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറായ miniSOG26, KillerRed23 എന്നിവയുടെ കഴിവ് ഞങ്ങൾ ആദ്യം പരിശോധിച്ചു, പ്രോട്ടീമിന്റെ പ്രൊപാർഗൈലാമൈൻ ലേബലിംഗിനെ ഒരു കെമിക്കൽ പ്രോബായി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1a) മധ്യസ്ഥമാക്കാൻ.ജെൽ ഫ്ലൂറസെൻസ് വിശകലനം കാണിക്കുന്നത് മിനിഎസ്ഒജിയും ബ്ലൂ ലൈറ്റ് റേഡിയേഷനും ഉപയോഗിച്ചാണ് പ്രോട്ടീം ലേബലിംഗ് മുഴുവനായും നേടിയത്, അതേസമയം കില്ലർറെഡിനൊപ്പം ദൃശ്യമായ ലേബലിംഗ് ഉൽപ്പന്നങ്ങളൊന്നും നിരീക്ഷിച്ചിട്ടില്ല.സിഗ്നൽ-ടു-പശ്ചാത്തല അനുപാതം മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ അനിലിൻ (1, 3), പ്രൊപിലാമൈൻ (2), അല്ലെങ്കിൽ ബെൻസിലാമൈൻ (4) എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു കൂട്ടം കെമിക്കൽ പ്രോബുകൾ പരീക്ഷിച്ചു.HEK293T സെല്ലുകൾക്ക് നീല വെളിച്ചവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഉയർന്ന പശ്ചാത്തല സിഗ്നൽ ഉണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, ഒരുപക്ഷേ എൻഡോജെനസ് റൈബോഫ്ലേവിൻ ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസർ, ഫ്ലേവിൻ മോണോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് (FMN) 27 . അനിലിൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള കെമിക്കൽ പ്രോബുകൾ 1 ഉം 3 ഉം മികച്ച പ്രത്യേകത നൽകി, HEK293T മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയിൽ miniSOG സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, പ്രോബ് 3-നുള്ള സിഗ്നലിൽ 8 മടങ്ങ് വർദ്ധനവ് കാണിക്കുന്നു, അതേസമയം RNA-ലേബലിംഗ് രീതി CAP-seq-ൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രോബ് 2 ~2.5- മാത്രം പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു. മടക്ക സിഗ്നൽ വർദ്ധനവ്, ആർഎൻഎയും പ്രോട്ടീനും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യസ്ത പ്രതിപ്രവർത്തന മുൻഗണനകൾ മൂലമാകാം (ചിത്രം 1 ബി, സി). അനിലിൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള കെമിക്കൽ പ്രോബുകൾ 1 ഉം 3 ഉം മികച്ച പ്രത്യേകത നൽകി, HEK293T മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയിൽ miniSOG സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, പ്രോബ് 3-നുള്ള സിഗ്നലിൽ 8 മടങ്ങ് വർദ്ധനവ് കാണിക്കുന്നു, അതേസമയം RNA-ലേബലിംഗ് രീതി CAP-seq-ൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രോബ് 2 ~2.5- മാത്രം പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു. മടക്ക സിഗ്നൽ വർദ്ധനവ്, ആർഎൻഎയും പ്രോട്ടീനും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യസ്ത പ്രതിപ്രവർത്തന മുൻഗണനകൾ മൂലമാകാം (ചിത്രം 1 ബി, സി).അനിലിൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള കെമിക്കൽ പ്രോബുകൾ 1 ഉം 3 ഉം മികച്ച പ്രത്യേകതകൾ കാണിച്ചു: മൈറ്റോകോൺഡ്രിയയിൽ miniSOG സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന HEK293T, പ്രോബ് 3 നുള്ള സിഗ്നലിൽ 8 മടങ്ങ് വർദ്ധനവ് കാണിക്കുന്നു, അതേസമയം പ്രോബ് 2, CAP-seq RNA ലേബലിംഗ് രീതിയിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു, മാത്രം. ~2.5 മടങ്ങ് സിഗ്നൽ വർദ്ധനവ് കാണിക്കുന്നു, ഒരുപക്ഷേ ആർഎൻഎയും പ്രോട്ടീനും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യസ്ത പ്രതിപ്രവർത്തന മുൻഗണനകൾ കാരണം (ചിത്രം 1 ബി, സി).基于 苯胺 的 化学 探针 和 3 和 更 的 的 特异性, HEK293T 在 线 粒体 中 表达 表达 表达 表达 表达 8 倍, 而 用 于 于 于 方法 方法 方法 方法 ~ ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b, c）。基于 苯胺 的 化学 探针 和 和 更 的 的 特异性, ഹെക്293t 特异性, ഹെക്293T, 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap ക്യാപ്-ഇക് 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ k 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAഅനിലിൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള കെമിക്കൽ പ്രോബുകൾ 1, 3 എന്നിവയ്ക്ക് മികച്ച പ്രത്യേകതയുണ്ടായിരുന്നു, HEK293T മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയിൽ സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന miniSOG, കൂടാതെ പ്രോബ് 3 സിഗ്‌നലിൽ 8 മടങ്ങ് വർദ്ധനയുണ്ടായി, അതേസമയം CAP-seq RNA ലേബലിംഗ് രീതിയുടെ അന്വേഷണം 2-ൽ ~2.5 മടങ്ങ് വർദ്ധനവ് മാത്രമേ കാണിക്കൂ.സിഗ്നലിൽ, ഒരുപക്ഷേ ആർഎൻഎയും പ്രോട്ടീനും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യസ്ത പ്രതികരണ മുൻഗണനകൾ മൂലമാകാം (ചിത്രം 1 ബി, സി).കൂടാതെ, പ്രോബ് 3 ഐസോമറുകളും ഹൈഡ്രാസൈൻ പ്രോബുകളും (പരീക്ഷണങ്ങൾ 5, 6, 7) പരീക്ഷിച്ചു, ഇത് പ്രോബ് 3 ന്റെ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 1 ബി, സി).അതുപോലെ, ഇൻ-ജെൽ ഫ്ലൂറസെൻസ് വിശകലനം മറ്റ് ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത പരീക്ഷണാത്മക പാരാമീറ്ററുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി: വികിരണ തരംഗദൈർഘ്യം (460 nm), കെമിക്കൽ പ്രോബ് കോൺസൺട്രേഷൻ (1 mM), റേഡിയേഷൻ സമയം (20 മിനിറ്റ്) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 2a-c).PDPL പ്രോട്ടോക്കോളിലെ ഏതെങ്കിലും ഘടകം അല്ലെങ്കിൽ ഘട്ടം ഒഴിവാക്കുന്നത് പശ്ചാത്തലത്തിലേക്ക് കാര്യമായ സിഗ്നൽ റിവേഴ്സലിന് കാരണമായി (ചിത്രം 1d).സോഡിയം അസൈഡിന്റെയോ ട്രോലോക്സിൻറെയോ സാന്നിധ്യത്തിൽ പ്രോട്ടീൻ ലേബലിംഗ് ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു, അവ ഒറ്റത്തവണ ഓക്സിജനെ ശമിപ്പിക്കുന്നു.സിംഗിൾ ഓക്സിജനെ സ്ഥിരപ്പെടുത്താൻ അറിയപ്പെടുന്ന D2O യുടെ സാന്നിധ്യം ലേബലിംഗ് സിഗ്നലിനെ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു.ലേബലിംഗിൽ മറ്റ് റിയാക്ടീവ് ഓക്സിജൻ സ്പീഷീസുകളുടെ സംഭാവനയെക്കുറിച്ച് അന്വേഷിക്കാൻ, യഥാക്രമം 18, 29 ഹൈഡ്രോക്സൈൽ, സൂപ്പർഓക്സൈഡ് റാഡിക്കൽ സ്കാവെഞ്ചറുകൾ സ്ഥാപിക്കാൻ മാനിറ്റോൾ, വിറ്റാമിൻ സി എന്നിവ ചേർത്തു, എന്നാൽ അവ ലേബലിംഗ് കുറയ്ക്കുന്നതായി കണ്ടെത്തിയില്ല.H2O2 ചേർക്കുന്നത്, പക്ഷേ പ്രകാശം അല്ല, ലേബലിംഗിന് കാരണമായില്ല (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 3a).HEK293T-miniSOG വയറിൽ സിംഗിൾ ഓക്‌സിജന്റെ സാന്നിധ്യം Si-DMA പ്രോബുകളുള്ള ഫ്ലൂറസെൻസ് സിംഗിൾ ഓക്‌സിജൻ ഇമേജിംഗ് സ്ഥിരീകരിച്ചു, എന്നാൽ യഥാർത്ഥ HEK293T വയറിൽ ഇല്ല.കൂടാതെ, mitoSOX Red ന് പ്രകാശത്തിന് ശേഷം സൂപ്പർഓക്സൈഡ് ഉത്പാദനം കണ്ടെത്താനായില്ല (ചിത്രം. 1e, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 3b) 30. ഈ ഡാറ്റ ശക്തമായി സൂചിപ്പിക്കുന്നത് സിംഗിൾ ഓക്സിജനാണ് തുടർന്നുള്ള പ്രോട്ടിയോമിക് ലേബലിംഗിന് ഉത്തരവാദികളായ പ്രധാന റിയാക്ടീവ് ഓക്സിജൻ സ്പീഷീസ്.ബ്ലൂ ലൈറ്റ് റേഡിയേഷനും കെമിക്കൽ പ്രോബുകളും ഉൾപ്പെടെ പിഡിപിഎല്ലിന്റെ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി വിലയിരുത്തി, കാര്യമായ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടില്ല (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4a).
ലേബലിംഗ് സംവിധാനം പഠിക്കുന്നതിനും LC-MS/MS ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളുടെ പ്രോട്ടീമിക് ഐഡന്റിഫിക്കേഷൻ പ്രാപ്തമാക്കുന്നതിനും, ഏത് അമിനോ ആസിഡുകളാണ് പരിഷ്കരിച്ചതെന്നും പ്രോബ് ലേബലുകളുടെ ഡെൽറ്റ പിണ്ഡവും ഞങ്ങൾ ആദ്യം നിർണ്ണയിക്കേണ്ടതുണ്ട്.മെഥിയോണിൻ, ഹിസ്റ്റിഡിൻ, ട്രിപ്റ്റോഫാൻ, ടൈറോസിൻ എന്നിവ സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ 14,15 പരിഷ്കരിച്ചതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.MSFragger32 അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള FragPipe കമ്പ്യൂട്ടിംഗ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോം നൽകുന്ന നിഷ്പക്ഷമായ തുറന്ന തിരയലുമായി ഞങ്ങൾ TOP-ABPP31 വർക്ക്ഫ്ലോ സമന്വയിപ്പിക്കുന്നു.സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ പരിഷ്ക്കരണത്തിനും കെമിക്കൽ പ്രോബ് ലേബലിംഗിനും ശേഷം, ക്ലീവബിൾ ലിങ്കർ അടങ്ങിയ ബയോട്ടിൻ റിഡക്ഷൻ ലേബൽ ഉപയോഗിച്ച് ക്ലിക്ക് കെമിസ്ട്രി നടത്തി, തുടർന്ന് ന്യൂട്രാവിഡിൻ സ്ട്രെച്ചിംഗും ട്രൈപ്സിൻ ദഹനവും.പരിഷ്കരിച്ച പെപ്റ്റൈഡ്, ഇപ്പോഴും റെസിനുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, LC-MS/MS വിശകലനത്തിനായി ഫോട്ടോക്ലീവ് ചെയ്തു (ചിത്രം 2 എയും അനുബന്ധ ഡാറ്റയും 1).50-ലധികം പെപ്റ്റൈഡ് മാപ്പ് (PSM) പൊരുത്തങ്ങൾ ലിസ്റ്റുചെയ്‌തിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടോമിലുടനീളം ധാരാളം പരിഷ്‌ക്കരണങ്ങൾ സംഭവിച്ചു (ചിത്രം 2 ബി).അതിശയകരമെന്നു പറയട്ടെ, മറ്റ് അമിനോ ആസിഡുകളെ അപേക്ഷിച്ച് അനിലിൻ പ്രോബുകളിലേക്കുള്ള ഓക്സിഡൈസ്ഡ് ഹിസ്റ്റിഡിൻ ഉയർന്ന പ്രതിപ്രവർത്തനം മൂലമാകാം, ഹിസ്റ്റിഡിൻ പരിഷ്ക്കരിക്കുന്നത് മാത്രമാണ് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചത്.സിംഗിൾ ഓക്‌സിജൻ വഴിയുള്ള ഹിസ്റ്റിഡിൻ ഓക്‌സിഡേഷന്റെ പ്രസിദ്ധപ്പെടുത്തിയ സംവിധാനം അനുസരിച്ച്, +229 Da യുടെ നിർദ്ദിഷ്ട ഡെൽറ്റ-മാസ് ഘടന രണ്ട് ഓക്‌സിഡേഷനുകൾക്ക് ശേഷം 2-ഓക്‌സോ-ഹിസ്റ്റിഡിൻ ഉള്ള പ്രോബ് 3 ന്റെ അഡക്‌റ്റുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, അതേസമയം +247 Da ജലവിശ്ലേഷണ ഉൽപ്പന്നമാണ്. +229 Da (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5).MS2 സ്പെക്ട്രത്തിന്റെ മൂല്യനിർണ്ണയം, മിക്ക y, b അയോണുകളുടെയും തിരിച്ചറിയലിന്റെ ഉയർന്ന വിശ്വാസ്യത കാണിച്ചു, പരിഷ്കരിച്ച ശകല അയോണുകളുടെ (y, b) തിരിച്ചറിയൽ ഉൾപ്പെടെ (ചിത്രം 2c).PDPL-പരിഷ്കരിച്ച ഹിസ്റ്റിഡൈനുകളുടെ പ്രാദേശിക ശ്രേണിയുടെ സന്ദർഭ വിശകലനം, ±1 സ്ഥാനങ്ങളിൽ ചെറിയ ഹൈഡ്രോഫോബിക് അവശിഷ്ടങ്ങൾക്ക് മിതമായ മോട്ടിഫ് മുൻഗണന വെളിപ്പെടുത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4b).ഒരു പ്രോട്ടീനിൽ ശരാശരി 1.4 ഹിസ്റ്റിഡിനുകൾ കണ്ടെത്തി, ഈ മാർക്കറുകളുടെ സൈറ്റുകൾ സോൾവന്റ് ആക്സസ് ചെയ്യാവുന്ന ഉപരിതല വിസ്തീർണ്ണവും (SASA) ആപേക്ഷിക ലായക ലഭ്യതയും (RSA) വിശകലനവും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4c,d) നിർണ്ണയിക്കുന്നു.
MSFragger നൽകുന്ന FragPipe കമ്പ്യൂട്ടിംഗ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോം ഉപയോഗിച്ച് ശേഷിക്കുന്ന സെലക്‌ടിവിറ്റി പഠിക്കുന്നതിനുള്ള നിഷ്പക്ഷമായ വർക്ക്ഫ്ലോ.സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ റെസിനിൽ നിന്ന് പരിഷ്കരിച്ച പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഫോട്ടോക്ലീവേജ് അനുവദിക്കുന്നതിന് ക്ലിക്ക് കെമിസ്ട്രിയിൽ ക്ലീവബിൾ ലിങ്കറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.നിരവധി പരിഷ്കാരങ്ങളും പ്രസക്തമായ അവശിഷ്ടങ്ങളും തിരിച്ചറിയാൻ ഒരു തുറന്ന തിരയൽ ആരംഭിച്ചു.b പ്രോട്ടിയോമിലുടനീളം സംഭവിക്കുന്ന പരിഷ്കാരങ്ങളുടെ പിണ്ഡം നൽകുക.പെപ്റ്റൈഡ് മാപ്പിംഗ് PSM.പ്രോബ് 3 ഉപയോഗിച്ച് പരിഷ്കരിച്ച ഹിസ്റ്റിഡിൻ സൈറ്റുകളുടെ സി MS2 സ്പെക്ട്രൽ വ്യാഖ്യാനം. ഒരു പ്രാതിനിധ്യ ഉദാഹരണമായി, പ്രോബ് 3 ഉള്ള ഒരു കോവാലന്റ് പ്രതികരണം പരിഷ്കരിച്ച അമിനോ ആസിഡിലേക്ക് +229.0938 Da ചേർത്തു.d PDPL മാർക്കറുകൾക്കായി പരീക്ഷിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന മ്യൂട്ടേഷൻ അസെ.PRDX3 (H155A, H225A), PRDX1 (H10A, H81A, H169A) എന്നിവ ഫ്ലാഗ് വിരുദ്ധ കണ്ടെത്തലിനായി വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് പ്ലാസ്മിഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റി.e സിന്തറ്റിക് പെപ്‌റ്റൈഡ് പ്രോബ് 3 ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ശുദ്ധീകരിച്ച miniSOG ഉപയോഗിച്ച് പ്രതികരിക്കുകയും LC-MS സ്പെക്‌ട്രത്തിൽ Δm +247, +229 എന്നിവയുള്ള അനുബന്ധ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ രേഖപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്തു.f ഇൻ വിട്രോ പ്രോട്ടീൻ-ടു-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ miniSOG-6xHis-tag, anti-6xHis ആന്റിബോഡി എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് മാതൃകയാക്കി.ആന്റിബയോട്ടിൻ (സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ-എച്ച്ആർപി), പ്രകാശം എക്സ്പോഷർ ചെയ്യുന്ന സമയത്തെ ആശ്രയിച്ച്, പ്രോബ് 3 ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്ത മിനിഎസ്ഒജി-6xഹിസ്/ആന്റി-6xഹിസ് ആന്റിബോഡി കോംപ്ലക്സുകളുടെ ആന്റി-മൗസ് വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് വിശകലനം.വ്യക്തിഗത പ്രോട്ടീനുകൾക്കുള്ള ലേബലുകൾ അനുബന്ധ തന്മാത്രാ ഭാരത്തിൽ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു: LC ആന്റിബോഡി ലൈറ്റ് ചെയിൻ, HC ആന്റിബോഡി ഹെവി ചെയിൻ.ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾ സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ കുറഞ്ഞത് രണ്ട് തവണയെങ്കിലും സ്വതന്ത്രമായി ആവർത്തിച്ചു.
ലേബലിംഗ് സൈറ്റിന്റെ ബയോകെമിക്കൽ പരിശോധനയ്ക്കായി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി വഴി തിരിച്ചറിഞ്ഞ PRDX3, PRDX1 എന്നിവ ഹിസ്റ്റിഡിനിൽ നിന്ന് അലനൈനിലേക്ക് മാറ്റി, ട്രാൻസ്ഫെക്ഷൻ അസെസിലെ വൈൽഡ് തരവുമായി താരതമ്യം ചെയ്തു.മ്യൂട്ടേഷൻ ലേബലിംഗിനെ ഗണ്യമായി കുറച്ചതായി PDPL ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചു (ചിത്രം 2d).അതേസമയം, ഓപ്പൺ സെർച്ചിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകൾ പ്രോബ് 3, ബ്ലൂ ലൈറ്റ് എന്നിവയുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ശുദ്ധീകരിച്ച മിനിഎസ്ഒജി ഉപയോഗിച്ച് വിട്രോയിൽ സംശ്ലേഷണം ചെയ്യുകയും LC-MS കണ്ടെത്തുമ്പോൾ +247, +229 Da എന്നിവയുടെ മാസ് ഷിഫ്റ്റുള്ള ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ നൽകുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം. .2e).).miniSOG ഫോട്ടോ ആക്റ്റിവേഷന് പ്രതികരണമായി ഇന്ററാക്ടിംഗ് പ്രോക്സിമൽ പ്രോട്ടീനുകളെ വിട്രോയിൽ ലേബൽ ചെയ്യാൻ കഴിയുമോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ, miniSOG-6xHis പ്രോട്ടീനും ആന്റി-ഹിസ് മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി ഇൻ വിട്രോയും തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിലൂടെ ഞങ്ങൾ ഒരു കൃത്രിമ പ്രോക്‌സിമിറ്റി അസ്സെ രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തു (ചിത്രം 2f).ഈ വിശകലനത്തിൽ, miniSOG ഉപയോഗിച്ച് ആന്റിബോഡി ഹെവി, ലൈറ്റ് ചെയിനുകളുടെ പ്രോക്സിമൽ ലേബലിംഗ് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിച്ചു.വാസ്തവത്തിൽ, ആന്റി-മൗസും (ആന്റി-6xഹിസ്-ലേബൽ ചെയ്ത ആന്റിബോഡിയുടെ ഭാരമേറിയതും ഭാരം കുറഞ്ഞതുമായ ശൃംഖലകൾ തിരിച്ചറിയുന്നു), സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടുകൾ കനത്തതും ഭാരം കുറഞ്ഞതുമായ ചെയിനുകളുടെ ശക്തമായ ബയോട്ടിനൈലേഷൻ കാണിച്ചു.6xHis ടാഗും ലൈറ്റ്, ഹെവി ചെയിനുകൾക്കിടയിലുള്ള ക്രോസ്-ലിങ്കുകളും കാരണം ഞങ്ങൾ മിനിSOG ഓട്ടോബയോട്ടിനൈലേഷൻ ശ്രദ്ധിച്ചു, ഇത് ലൈസിനും 2-ഓക്‌സോ-ഹിസ്റ്റിഡിൻ പ്രോക്സിമൽ പ്രതികരണവും തമ്മിലുള്ള മുമ്പ് വിവരിച്ച വിടവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം.ഉപസംഹാരമായി, പി‌ഡി‌പി‌എൽ ഹിസ്റ്റിഡിനെ പ്രോക്‌സിമിറ്റി ആശ്രിത രീതിയിൽ പരിഷ്‌ക്കരിക്കുന്നു എന്ന് ഞങ്ങൾ നിഗമനം ചെയ്യുന്നു.
ഇൻ സിറ്റു ലേബലിംഗിന്റെ പ്രത്യേകത പരിശോധിക്കുന്നതിനായി സബ്സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടീമിനെ വിശേഷിപ്പിക്കുക എന്നതായിരുന്നു ഞങ്ങളുടെ അടുത്ത ലക്ഷ്യം.അതിനാൽ, HEK293T സെല്ലുകളുടെ ന്യൂക്ലിയസ്, മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ മാട്രിക്സ്, അല്ലെങ്കിൽ ബാഹ്യ ER മെംബ്രൺ എന്നിവയിൽ ഞങ്ങൾ സ്ഥിരമായി miniSOG പ്രകടിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 3a).ജെൽ ഫ്ലൂറസെൻസ് വിശകലനം മൂന്ന് ഉപസെല്ലുലാർ ലൊക്കേഷനുകളിൽ ധാരാളം ലേബൽ ചെയ്ത ബാൻഡുകളും വ്യത്യസ്ത ലേബലിംഗ് പാറ്റേണുകളും വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 3 ബി).ഫ്ലൂറസെൻസ് ഇമേജിംഗ് വിശകലനം PDPL ന്റെ ഉയർന്ന പ്രത്യേകത കാണിച്ചു (ചിത്രം 3c).ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് സബ്സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടിയോമുകൾ നിർവചിക്കുന്നതിനായി റോഡാമൈൻ ഡൈകൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ക്ലിക്ക് പ്രതികരണങ്ങൾ PDPL വർക്ക്ഫ്ലോയെ തുടർന്നു, PDPL സിഗ്നലുകൾ DAPI, മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ ട്രാക്കറുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ER ട്രാക്കറുകൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് പിഡിപിഎല്ലിന്റെ ഉയർന്ന വിശ്വാസ്യത സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു.മൂന്ന് ഓർഗനെല്ലെ ലൊക്കേഷനുകൾക്കായി, അവിഡിൻ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് ഉപയോഗിച്ച് TurboID-യുമായി PDPL-നെ ഒരു വശത്ത് താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, PDPL അവയുടെ നിയന്ത്രണങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ കൂടുതൽ വ്യക്തമായി ലേബൽ ചെയ്തിട്ടുണ്ടെന്ന് കാണിക്കുന്നു.PDPL സാഹചര്യങ്ങളിൽ, കൂടുതൽ ലേബൽ ചെയ്ത ബാൻഡുകൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ടു, ഇത് കൂടുതൽ PDPL-ലേബൽ ചെയ്ത പ്രോട്ടീനുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 6a-d).
miniSOG-മെഡിയേറ്റഡ് ഓർഗനെൽ-സ്പെസിഫിക് പ്രോട്ടിയോം ലേബലിംഗിന്റെ ഒരു സ്കീമാറ്റിക് പ്രാതിനിധ്യം.മനുഷ്യ COX4 (mito-miniSOG) ന്റെ N-ടെർമിനൽ 23 അമിനോ ആസിഡുകളിലേക്കുള്ള സംയോജനത്തിലൂടെ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ മാട്രിക്‌സിനെ miniSOG ലക്ഷ്യമിടുന്നു, ന്യൂക്ലിയസ് H2B (nucleus-miniSOG), ER മെംബ്രണിന്റെ (ER-miniSOG) സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് വശം വഴി Sec61β. ).സൂചനകളിൽ ജെൽ ഇമേജിംഗ്, കൺഫോക്കൽ ഇമേജിംഗ്, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.b മൂന്ന് ഓർഗനെൽ-നിർദ്ദിഷ്ട PDPL പ്രൊഫൈലുകളുടെ പ്രതിനിധി ജെൽ ചിത്രങ്ങൾ.CBB കുമാസി ബ്രില്ല്യന്റ് ബ്ലൂ.c, V5 (ചുവപ്പ്) എന്ന് ലേബൽ ചെയ്‌ത ആന്റിബോഡി കണ്ടെത്തിയ വ്യത്യസ്ത ഉപസെല്ലുലാർ ലോക്കലൈസേഷനുകൾക്കൊപ്പം മിനിSOG സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന HEK293T സെല്ലുകളുടെ പ്രതിനിധി കോൺഫോക്കൽ ഇമേജുകൾ.മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയ, ഇആർ (പച്ച) എന്നിവയ്‌ക്ക് ഉപസെല്ലുലാർ മാർക്കറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.PDPL വർക്ക്ഫ്ലോയിൽ Cy3-azide ക്ലിക്ക് കെമിസ്ട്രി ഉപയോഗിച്ച് miniSOG (മഞ്ഞ) ലേബൽ ചെയ്ത സബ്സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടിയോമുകൾ കണ്ടെത്തുന്നത് ഉൾപ്പെടുന്നു.സ്കെയിൽ ബാർ: 10 µm.d ലേബൽ ചെയ്യാത്ത ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ (n = 3 സ്വതന്ത്ര ബയോളജിക്കൽ പരീക്ഷണങ്ങൾ) ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കിയ വിവിധ അവയവങ്ങളിലെ PDPL-ടാഗ് ചെയ്ത പ്രോട്ടിയോമുകളുടെ അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ടുകൾ.അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ടുകളിൽ ടു-ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചു.HEK293T വൈൽഡ് തരം നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിച്ചു. ഗണ്യമായി മാറിയ പ്രോട്ടീനുകൾ ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (p <0.05, >2-മടങ്ങ് അയോൺ തീവ്രത വ്യത്യാസം). ഗണ്യമായി മാറിയ പ്രോട്ടീനുകൾ ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (p <0.05, >2-മടങ്ങ് അയോൺ തീവ്രത വ്യത്യാസം). വിജ്ഞാനകോശം (p <0,05 и > 2-ക്രട്ടണിയ റഷ്യയിൽ നിന്ന്). കാര്യമായ മാറ്റം വരുത്തിയ പ്രോട്ടീനുകൾ ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (p <0.05 ഒപ്പം > അയോൺ തീവ്രതയിൽ 2 മടങ്ങ് വ്യത്യാസം).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно изменные белки выделены krasnыm цетом (p <0,05 и > 2-ക്രട്ടണിയ റാസ്നിഷയിൽ നിന്ന് ионной силее). കാര്യമായ മാറ്റം വരുത്തിയ പ്രോട്ടീനുകൾ ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (p <0.05 and > 2-മടങ്ങ് വ്യത്യാസം അയോണിക് ശക്തിയിൽ).HEK293T-miniSOG-ന് പ്രധാനപ്പെട്ടതും എന്നാൽ HEK293T-യ്ക്ക് പ്രധാനമല്ലാത്തതുമായ അനുബന്ധ പ്രോട്ടീനുകൾ പച്ചയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.ഇ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള പ്രോട്ടിയോമിക് ഡാറ്റാസെറ്റുകളുടെ പ്രത്യേകതയുടെ വിശകലനം ഡി.ഓരോ അവയവത്തിലും (ചുവപ്പ്, പച്ച ഡോട്ടുകൾ) സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കനുസരിച്ച് പ്രാധാന്യമുള്ള പ്രോട്ടീനുകളുടെ ആകെ എണ്ണം മുകളിൽ അടയാളപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു.MitoCarta 3.0, GO വിശകലനം, A. Ting et al എന്നിവയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള അവയവങ്ങളിൽ പ്രാദേശികവൽക്കരിച്ച പ്രോട്ടീനുകൾ ഹിസ്റ്റോഗ്രാമുകൾ കാണിക്കുന്നു.ആളുകൾ.മൈറ്റോകോൺഡ്രിയ, ന്യൂക്ലിയസ്, ഇആർ എന്നിവയ്‌ക്കായി പ്രത്യേക ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ.ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾ സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ കുറഞ്ഞത് രണ്ട് തവണയെങ്കിലും സ്വതന്ത്രമായി ആവർത്തിച്ചു.റോ ഡാറ്റ ഫയലുകളുടെ രൂപത്തിലാണ് റോ ഡാറ്റ നൽകിയിരിക്കുന്നത്.
ജെൽ, ഇമേജിംഗ് ഫലങ്ങൾ എന്നിവയാൽ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കപ്പെട്ടതിനാൽ, ഓരോ അവയവത്തിലും തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രോട്ടിയോമിനെ അളക്കാൻ ലേബൽ-ഫ്രീ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ ഉപയോഗിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ 2).ബാക്ക്ഗ്രൗണ്ട് മാർക്കറുകൾ കുറയ്ക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു നെഗറ്റീവ് കൺട്രോളായി മാറ്റപ്പെടാത്ത HEK293T ഉപയോഗിച്ചു. അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ട് വിശകലനം ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമായ പ്രോട്ടീനുകളും (p <0.05 ഒപ്പം >2-മടങ്ങ് അയോൺ തീവ്രത) കൂടാതെ miniSOG- പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ലൈനുകളിൽ മാത്രം കാണപ്പെടുന്ന സിംഗിൾടൺ പ്രോട്ടീനുകളും (ചിത്രം 3d ചുവപ്പും പച്ചയും ഡോട്ടുകൾ) പ്രദർശിപ്പിച്ചു. അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ട് വിശകലനം ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമായ പ്രോട്ടീനുകളും (p <0.05 ഒപ്പം >2-മടങ്ങ് അയോൺ തീവ്രത) കൂടാതെ miniSOG- പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ലൈനുകളിൽ മാത്രം കാണപ്പെടുന്ന സിംഗിൾടൺ പ്രോട്ടീനുകളും (ചിത്രം 3d ചുവപ്പും പച്ചയും ഡോട്ടുകൾ) പ്രദർശിപ്പിച്ചു. Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ട് വിശകലനം ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമായ പ്രോട്ടീനുകളും (p<0.05 ഒപ്പം > 2-മടങ്ങ് അയോൺ തീവ്രത) കൂടാതെ miniSOG- പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ലൈനുകളിൽ (ചിത്രം. 3d, ചുവപ്പും പച്ചയും ഡോട്ടുകൾ) മാത്രമുള്ള ഒറ്റ പ്രോട്ടീനുകളും കാണിച്ചു.火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 (p <0.05 和> 2 倍 离子 强度) 以及 仅 存 在于 MINISOG 表达 系 的 单一 蛋白质 (图 3D 红色 红色 绿色点).火山图火山图 显示 出 显着 的 蛋白质 (p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 强度) 仅 存 在于 在于 离子 离子 的 单一 蛋白质 (图 3D 的红色 ...))))))))))))))))))))))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ട് വിശകലനം ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമായ പ്രോട്ടീനുകളും (p<0.05 and >2x അയോണിക് ശക്തിയും) അതുപോലെ തന്നെ miniSOG എക്സ്പ്രഷൻ ലൈനിൽ മാത്രം ഉള്ള ഒറ്റ പ്രോട്ടീനുകളും വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 3d ലെ ചുവപ്പും പച്ചയും ഡോട്ടുകൾ).ഈ ഡാറ്റ സംയോജിപ്പിച്ച്, ഞങ്ങൾ യഥാക്രമം 1364, 461, 911 സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ പ്രാധാന്യമുള്ള ന്യൂക്ലിയർ, മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ, ER ബാഹ്യ മെംബ്രൻ പ്രോട്ടീനുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു.ഓർഗനെല്ലെ-ലോക്കലൈസ്ഡ് PDPL-ന്റെ കൃത്യത വിശകലനം ചെയ്യാൻ, ഞങ്ങൾ MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) വിശകലനം, A. Ting et al എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചു.73.4, 78.5, 73.0% (ചിത്രം 3e) എന്നിവയുടെ കൃത്യതയ്ക്ക് അനുസൃതമായി കണ്ടെത്തിയ പ്രോട്ടീനുകളുടെ അവയവങ്ങളുടെ പ്രത്യേകത പരിശോധിക്കാൻ മൈറ്റോകോൺഡ്രിയ, ന്യൂക്ലിയസ്, ER എന്നിവയ്ക്കായി ഒരു ഡാറ്റ സെറ്റ്8 ഉപയോഗിച്ചു.പിഡിപിഎല്ലിന്റെ പ്രത്യേകത, ഓർഗനെല്ലെ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രോട്ടിയോമുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിനുള്ള അനുയോജ്യമായ ഉപകരണമാണ് പിഡിപിഎൽ എന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു.തിരിച്ചറിഞ്ഞ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ സബ്‌മിറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ വിശകലനം, കുടുങ്ങിയ പ്രോട്ടീം പ്രധാനമായും മാട്രിക്‌സിലും ആന്തരിക മെംബ്രണിലും (യഥാക്രമം 226, 106) വിതരണം ചെയ്തിട്ടുണ്ടെന്ന് കാണിക്കുന്നു, ഇത് തിരിച്ചറിഞ്ഞ മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ മൊത്തം എണ്ണത്തിന്റെ 91.7% (362) ആണ്.ഒരു ഉയർന്ന തലത്തിലുള്ള PDPL അധികമായി സ്ഥിരീകരിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 7a).അതുപോലെ, സബ് ന്യൂക്ലിയർ വിശകലനം കാണിക്കുന്നത് പിടിച്ചെടുത്ത പ്രോട്ടിയോം പ്രധാനമായും ന്യൂക്ലിയസ്, ന്യൂക്ലിയോപ്ലാസം, ന്യൂക്ലിയോലസ് എന്നിവയിലാണ് (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7 ബി).ന്യൂക്ലിയർ ലോക്കലൈസേഷൻ സിഗ്നൽ പെപ്റ്റൈഡ് (3xNLS) ഉപയോഗിച്ചുള്ള ന്യൂക്ലിയർ പ്രോട്ടോമിക് വിശകലനം H2B നിർമ്മാണത്തിന് സമാനമായ കൃത്യത കാണിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 7c-h).PDPL മാർക്കറിന്റെ പ്രത്യേകത നിർണ്ണയിക്കാൻ, ന്യൂക്ലിയർ ലാമിനിൻ എ, കൂടുതൽ വ്യതിരിക്തമായി പ്രാദേശികവൽക്കരിച്ച POI7 ട്രാപ്പായി തിരഞ്ഞെടുത്തു.PDPL ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമായ 36 പ്രോട്ടീനുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, അതിൽ 12 പ്രോട്ടീനുകൾ (ലാമിൻ എ ഉൾപ്പെടെ 30.0%) സ്ട്രിംഗ് ഡാറ്റാബേസ് വ്യാഖ്യാനിച്ച ലാമിൻ എ ഇന്ററാക്ടിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളാണ്, ബയോഐഡി രീതിയേക്കാൾ ഉയർന്ന ശതമാനം (122 പ്രോട്ടീനുകൾ) 28 ൽ 28. , 22.9. %) 7. ഞങ്ങളുടെ രീതി കുറച്ച് പ്രോട്ടീനുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, ഒരുപക്ഷേ പരിമിതമായ ലേബലിംഗ് ഏരിയകൾ കാരണം, ഇത് കൂടുതൽ സജീവമായ സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ വഴി സാധ്യമാക്കി.തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രോട്ടീനുകൾ പ്രധാനമായും ന്യൂക്ലിയോപ്ലാസം (26), ന്യൂക്ലിയർ മെംബ്രൺ (10), ന്യൂക്ലിയർ മെംബ്രൺ (9), ന്യൂക്ലിയർ സുഷിരങ്ങൾ (5) എന്നിവയിലാണെന്ന് GO വിശകലനം കാണിക്കുന്നു.മൊത്തത്തിൽ, ഈ ന്യൂക്ലിയർ-ലോക്കലൈസ്ഡ് പ്രോട്ടീനുകൾ സമ്പുഷ്ടമായ പ്രോട്ടീനുകളുടെ 80% വരും, ഇത് PDPL ന്റെ പ്രത്യേകതയെ കൂടുതൽ പ്രകടമാക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 8a-d).
അവയവങ്ങളിൽ പ്രോക്സിമിറ്റി അടയാളപ്പെടുത്തൽ നടത്താൻ PDPL-ന്റെ കഴിവ് സ്ഥാപിച്ച ശേഷം, POI ബൈൻഡിംഗ് പങ്കാളികളെ വിശകലനം ചെയ്യാൻ PDPL ഉപയോഗിക്കാമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.പ്രത്യേകിച്ചും, സൈറ്റോസോളിക് പ്രോട്ടീനുകളുടെ PDPL വിശകലനം നിർവചിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശ്രമിച്ചു, അവയുടെ ഉയർന്ന ചലനാത്മക സ്വഭാവം കാരണം അവയുടെ മെംബ്രൻ-ലോക്കലൈസ്ഡ് എതിരാളികളേക്കാൾ കൂടുതൽ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള ലക്ഷ്യങ്ങളായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു.ബ്രോമോഡൊമൈൻ, എക്സ്ട്രാ ടെർമിനൽ (ബിഇടി) പ്രോട്ടീൻ BRD4 വിവിധ രോഗങ്ങളിൽ അതിന്റെ പ്രധാന പങ്ക് നമ്മുടെ ശ്രദ്ധ ആകർഷിച്ചു 35, 36 .BRD4 രൂപീകരിച്ച സമുച്ചയം ഒരു ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ കോ ആക്റ്റിവേറ്ററും ഒരു പ്രധാന ചികിത്സാ ലക്ഷ്യവുമാണ്.c-myc, Wnt5a ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളുടെ പ്രകടനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ, അക്യൂട്ട് മൈലോയ്ഡ് ലുക്കീമിയ (AML), മൾട്ടിപ്പിൾ മൈലോമ, ബർക്കിറ്റിന്റെ ലിംഫോമ, വൻകുടൽ കാൻസർ, കോശജ്വലന രോഗങ്ങൾ എന്നിവയുടെ പ്രധാന നിർണ്ണായകമാണ് BRD4 എന്ന് കരുതപ്പെടുന്നു37,38.കൂടാതെ, പാപ്പിലോമ വൈറസ്, എച്ച്ഐവി, SARS-CoV-236,39 തുടങ്ങിയ വൈറൽ, സെല്ലുലാർ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ നിയന്ത്രിക്കാൻ ചില വൈറസുകൾ BRD4 ലക്ഷ്യമിടുന്നു.
PDPL ഉപയോഗിച്ച് BRD4 ഇടപെടൽ മാപ്പ് ചെയ്യുന്നതിന്, BRD4-ന്റെ ഒരു ചെറിയ N- അല്ലെങ്കിൽ C-ടെർമിനൽ ഐസോഫോമുമായി ഞങ്ങൾ miniSOG സംയോജിപ്പിച്ചു.പ്രോട്ടിയോമിക് ഫലങ്ങൾ രണ്ട് നിർമ്മിതികൾക്കിടയിൽ ഉയർന്ന തോതിലുള്ള ഓവർലാപ്പ് വെളിപ്പെടുത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 9a).miniSOG-H2B ഉപയോഗിച്ച് തിരിച്ചറിഞ്ഞ ന്യൂക്ലിയർ പ്രോട്ടീം, BRD4-മായി സംവദിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ 77.6% ഉൾക്കൊള്ളുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 9b).തുടർന്ന്, മാർക്കർ ആരം ക്രമീകരിക്കാൻ (ചിത്രം. 4a, അനുബന്ധ ഡാറ്റ 3) പ്രകാശത്തിന്റെ വ്യത്യസ്ത സമയങ്ങൾ (2, 5, 10, 20 മിനിറ്റ്) ഉപയോഗിച്ചു.ചെറിയ ഫോട്ടോപീരിയോഡുകളിൽ, PDPL പ്രാഥമികമായി നേരിട്ടുള്ള ബന്ധിത പങ്കാളികളെ ലേബൽ ചെയ്യുമെന്ന് ഞങ്ങൾ നിഗമനം ചെയ്യുന്നു.വാസ്തവത്തിൽ, അടുത്തുള്ള സമയ പോയിന്റുകൾക്കിടയിൽ ശക്തമായ ഓവർലാപ്പ് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (2, 5 മിനിറ്റുകൾക്ക് 84.6%; 5, 10 മിനിറ്റുകൾക്ക് 87.7%; 10, 20 മിനിറ്റുകൾക്ക് 98.7%) (ചിത്രം. 4b, അനുബന്ധ ചിത്രം 9c ).എല്ലാ പരീക്ഷണ ഗ്രൂപ്പുകളിലും, BRD4 സ്വയം-ലേബലിംഗ് മാത്രമല്ല, MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, HMGB1 എന്നിവ പോലുള്ള അറിയപ്പെടുന്ന നിരവധി ടാർഗെറ്റുകളും സ്‌ട്രിംഗ് ഡാറ്റാബേസിൽ വ്യാഖ്യാനിച്ചിട്ടുണ്ട്.ഈ ടാർഗെറ്റുകളുടെ അയോണിക് ശക്തി എക്സ്പോഷർ സമയത്തിന് ആനുപാതികമാണ് (ചിത്രം 4 സി, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 9 ഡി).2-മിനിറ്റ് ഗ്രൂപ്പിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രോട്ടീനുകളുടെ GO വിശകലനം, തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രോട്ടീനുകൾ ന്യൂക്ലിയസിൽ പ്രാദേശികവൽക്കരിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്നും ക്രോമാറ്റിൻ പുനർനിർമ്മാണത്തിലും ആർഎൻഎ പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനത്തിലും ഏർപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്നും കാണിച്ചു.പ്രോട്ടീന്റെ തന്മാത്രാ പ്രവർത്തനം ക്രോമാറ്റിൻ ബൈൻഡിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ കോ ആക്ടിവേഷൻ, BRD4 ഫംഗ്ഷനുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 4d).BRD4, HDAC ബൈൻഡിംഗ് അസറ്റിലേറ്റഡ് ഹിസ്റ്റോണുകൾ എന്നിവയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന SIN3A, NCOR2, BCOR, SAP130 (ചിത്രം. 4e, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 9e) എന്നിങ്ങനെ BRD4-ഉം HDAC ഫാമിലി ഇന്ററാക്ടിംഗ് കോംപ്ലക്സുകളും തമ്മിലുള്ള പരോക്ഷമായ ഇടപെടലുകളുടെ ആദ്യ തലം സ്‌ട്രിംഗ് ഡാറ്റാബേസ്-പ്രാപ്‌തമാക്കിയ പ്രോട്ടീൻ ഇന്ററാക്ഷൻ വിശകലനം വെളിപ്പെടുത്തി. ..കൂടാതെ, Sin3A, NSUN2, Fus, SFPQ എന്നിവയുൾപ്പെടെ LC-MS/MS തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രതിനിധി ലക്ഷ്യങ്ങൾ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 4f).അടുത്തിടെ, BRD4 ന്റെ ഹ്രസ്വ ഐസോഫോം ദ്രാവക-ദ്രാവക ഘട്ടം വേർതിരിക്കൽ (LLPS) ഗുണങ്ങളുള്ള അണുകേന്ദ്രങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.RNA ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളായ Fus, SFPQ എന്നിവ വിവിധ സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകളുടെ LLPS-നെ മധ്യസ്ഥമാക്കുന്നു, അവ ഇവിടെ രേഖപ്പെടുത്താത്ത BRD4 ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളായി തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്.BRD4-ഉം SFPQ-ഉം തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം കോ-ഇമ്മ്യൂണോപ്രിസിപിറ്റേഷൻ (കോ-ഐപി) പരീക്ഷണങ്ങളിലൂടെ സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 4g), കൂടുതൽ അന്വേഷണത്തിന് അർഹമായ BRD4-മെഡിയേറ്റഡ് ലിക്വിഡ്-ലിക്വിഡ് ഫേസ് വേർതിരിവിനുള്ള മറ്റൊരു സംവിധാനം നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.ഒരുമിച്ചു നോക്കിയാൽ, അറിയപ്പെടുന്ന BRD4 ഇന്ററാക്ടിംഗും അജ്ഞാതമായ ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളും തിരിച്ചറിയുന്നതിനുള്ള അനുയോജ്യമായ പ്ലാറ്റ്ഫോമാണ് PDPL എന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
miniSOG-മെഡിയേറ്റഡ് BRD4 പ്രോക്സിമിറ്റി അടയാളപ്പെടുത്തലിന്റെ ഒരു സ്കീമാറ്റിക് പ്രാതിനിധ്യം, എക്സ്പോഷർ സമയം: 2, 5, 10, 20 മിനിറ്റ്.b വ്യത്യസ്ത പ്രകാശ സമയങ്ങളിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഓവർലാപ്പ്.വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് HEK293T-യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ HEK293T-miniSOG-BRD4-ൽ കണ്ടെത്തിയ പ്രോട്ടീൻ സമ്പുഷ്ടീകരണം സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് പ്രാധാന്യമുള്ളതാണ്.c നിർദ്ദിഷ്‌ട എക്‌സ്‌പോഷർ സമയത്ത് ലേബൽ ചെയ്യാത്ത പ്രതിനിധി അറിയപ്പെടുന്ന BRD4-ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ അളവ് കണക്കാക്കുമ്പോൾ അയോൺ തീവ്രത.n = 3 ജൈവശാസ്ത്രപരമായി സ്വതന്ത്ര സാമ്പിളുകൾ.ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ ആയി ഡാറ്റ അവതരിപ്പിക്കുന്നു.d 2-മിനിറ്റ് ഗ്രൂപ്പിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ജീൻ ഓന്റോളജിക്കൽ അനാലിസിസ് (GO).ആദ്യത്തെ പത്ത് GO നിബന്ധനകൾ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.GO ടേം വിഭാഗത്തിന് അനുസരിച്ചാണ് കുമിളകൾക്ക് നിറം നൽകിയിരിക്കുന്നത്, ഓരോ പദത്തിലും കാണപ്പെടുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ എണ്ണത്തിന് ആനുപാതികമാണ് ബബിൾ വലുപ്പം.ഇ BRD4-മായി സംവദിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ സ്ട്രിംഗ് വിശകലനം.മഞ്ഞ വൃത്തങ്ങൾ നേരിട്ടുള്ള പശയും ചാര വൃത്തങ്ങൾ പരോക്ഷ പശയുടെ ആദ്യ പാളിയുമാണ്.ചുവന്ന വരകൾ പരീക്ഷണാത്മകമായി നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ട ഇടപെടലുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, നീല വരകൾ പ്രവചിച്ച ഇടപെടലുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.f LC-MS/MS-ൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുള്ള പ്രതിനിധി BRD4 ബൈൻഡിംഗ് ടാർഗെറ്റുകൾ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി പരിശോധിച്ചു.g കോ-ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷൻ പരീക്ഷണങ്ങൾ SFPQ ഉം BRD4 ഉം തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു.ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾ സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ കുറഞ്ഞത് രണ്ട് തവണയെങ്കിലും സ്വതന്ത്രമായി ആവർത്തിച്ചു.റോ ഡാറ്റ ഫയലുകളുടെ രൂപത്തിലാണ് റോ ഡാറ്റ നൽകിയിരിക്കുന്നത്.
രജിസ്റ്റർ ചെയ്യാത്ത POI-അസോസിയേറ്റഡ് ടാർഗെറ്റുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിനൊപ്പം, എൻസൈമുകൾക്കായുള്ള സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിന് PDPL അനുയോജ്യമാകുമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു, രജിസ്റ്റർ ചെയ്യാത്ത സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളെ വ്യാഖ്യാനിക്കുന്നതിന് വലിയ സമുച്ചയങ്ങളിലെ പരോക്ഷ ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ സ്വഭാവം ആവശ്യമായി വരും.പാർക്കിൻ (PARK2 എൻകോഡ് ചെയ്‌തത്) ഒരു E3 ലിഗേസാണ്, പാർക്കിനിലെ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ ഓട്ടോസോമൽ റീസെസീവ് ജുവനൈൽ പാർക്കിൻസൺസ് രോഗത്തിന് (AR-JP) കാരണമാകുമെന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു.കൂടാതെ, മൈറ്റോഫാഗിക്കും (മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ ഓട്ടോഫാഗി) റിയാക്ടീവ് ഓക്സിജൻ സ്പീഷീസുകൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനും പാർക്കിൻ അത്യാവശ്യമാണെന്ന് വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട്.എന്നിരുന്നാലും, നിരവധി പാർക്കിൻ അടിവസ്ത്രങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ഈ രോഗത്തിൽ പാർക്കിന്റെ പങ്ക് വ്യക്തമല്ല.അതിന്റെ അടയാളപ്പെടുത്താത്ത സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകൾ വ്യാഖ്യാനിക്കുന്നതിനായി, പാർക്കിന്റെ N- അല്ലെങ്കിൽ C-ടെർമിനസിലേക്ക് മിനിSOG ചേർത്ത് PDPL പരീക്ഷിച്ചു.PINK1-Parkin പാത്ത്‌വേ വഴി പാർക്കിൻ സജീവമാക്കാൻ കോശങ്ങളെ കാർബോണൈൽ സയനൈഡ് പ്രോട്ടോൺ ട്രാൻസ്പോർട്ടർ എം-ക്ലോറോഫെനൈൽഹൈഡ്രാസോൺ (CCCP) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു.ഞങ്ങളുടെ BRD4 PDPL ഫലങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, പാർക്കിൻ എൻ-ടെർമിനസ് ഫ്യൂഷൻ ടാർഗെറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഒരു വലിയ സെറ്റ് വെളിപ്പെടുത്തി, എന്നിരുന്നാലും ഇത് സി-ടെർമിനസിന്റെ വലിയൊരു ഭാഗം ഉൾക്കൊള്ളുന്നു (210 ൽ 177) (ചിത്രം 5 എ, ബി, സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ 4).എൻ-ടെർമിനൽ ടാഗുകൾക്ക് Parkin44-നെ വ്യത്യസ്‌തമായി പ്രവർത്തനക്ഷമമാക്കാൻ കഴിയുമെന്ന റിപ്പോർട്ടുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നതാണ് ഫലം.അതിശയകരമെന്നു പറയട്ടെ, പാർക്കിൻ 43-നുള്ള പ്രസിദ്ധീകരിച്ച AP-MS ഫലങ്ങൾക്കൊപ്പം ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റയിൽ 18 ഓവർലാപ്പിംഗ് പ്രോട്ടീനുകൾ മാത്രമേ ഉണ്ടായിരുന്നുള്ളൂ, ഇത് സെൽ ലൈനുകളും പ്രോട്ടിയോമിക്സ് വർക്ക്ഫ്ലോകളും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം മൂലമാകാം.അറിയപ്പെടുന്ന നാല് പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് പുറമേ (ARDM1, HSPA8, PSMD14, PSMC3) രണ്ട് രീതികളിലൂടെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു (ചിത്രം 5c)43.LC-MS/MS-ന്റെ ഫലങ്ങൾ കൂടുതൽ സാധൂകരിക്കുന്നതിന്, HEK293T പാരന്റ് സെൽ അസെയുടെയും സ്ഥിരതയുള്ള N-ടെർമിനൽ പാർക്കിൻ ലൈനിന്റെയും ഫലങ്ങൾ താരതമ്യം ചെയ്യാൻ PDPL ചികിത്സയും തുടർന്നുള്ള വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗും ഉപയോഗിച്ചു.മുമ്പ് അറിയപ്പെടാത്ത ലക്ഷ്യങ്ങളായ CDK2, DUT, CTBP1, PSMC4 എന്നിവ DNAJB1 എന്ന അറിയപ്പെടുന്ന ബൈൻഡർ ഉപയോഗിച്ച് പരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 5d).
HEK293T സെല്ലുകളിലെ പാർക്കിൻ-ഇന്ററാക്ടിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ട്, സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന miniSOG പാർക്കിന്റെ N- അല്ലെങ്കിൽ C-ടെർമിനസുമായി സംയോജിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു (n = 3 സ്വതന്ത്ര ജൈവ പരീക്ഷണങ്ങൾ).അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ടുകളിൽ ടു-ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചു.HEK293T നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിച്ചു. ഗണ്യമായി മാറിയ പ്രോട്ടീനുകൾ ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (p <0.05, >2-മടങ്ങ് അയോൺ തീവ്രത വ്യത്യാസം). ഗണ്യമായി മാറിയ പ്രോട്ടീനുകൾ ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (p <0.05, >2-മടങ്ങ് അയോൺ തീവ്രത വ്യത്യാസം). വിജ്ഞാനകോശം (p <0,05 и > 2-ക്രട്ടണിയ റഷ്യയിൽ നിന്ന്). കാര്യമായ മാറ്റം വരുത്തിയ പ്രോട്ടീനുകൾ ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (p <0.05 ഒപ്പം > അയോൺ തീവ്രതയിൽ 2 മടങ്ങ് വ്യത്യാസം).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно изменные белки выделены krasnыm цетом (p <0,05 и > 2-ക്രട്ടണിയ റാസ്നിഷയിൽ നിന്ന് ионной силее). കാര്യമായ മാറ്റം വരുത്തിയ പ്രോട്ടീനുകൾ ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (p <0.05 and > 2-മടങ്ങ് വ്യത്യാസം അയോണിക് ശക്തിയിൽ).HEK293T-miniSOG-ന് പ്രധാനപ്പെട്ടതും എന്നാൽ HEK293T-യ്ക്ക് പ്രധാനമല്ലാത്തതുമായ അനുബന്ധ പ്രോട്ടീനുകൾ പച്ചയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.b N-ടെർമിനൽ, C-ടെർമിനൽ നിർമ്മിതികൾക്കിടയിൽ ഓവർലാപ്പിംഗ് പ്രോട്ടീനുകൾ കാണിക്കുന്ന വെൻ ഡയഗ്രം.എൻ-ടെർമിനൽ ടാഗുകൾക്ക് പാർക്കിൻ സജീവമാക്കാനും കൂടുതൽ തിരിച്ചറിയാവുന്ന പ്രോട്ടീനുകൾ ഉണ്ടാകാനും കഴിയും.സി വെൻ ഡയഗ്രം PDPL, AP-MS എന്നിവയ്ക്കിടയിലുള്ള ഓവർലാപ്പിംഗ് പ്രോട്ടീനുകൾ കാണിക്കുന്നു.PDPL-ൽ പ്രത്യേകമായി തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുള്ള 18 ഓവർലാപ്പിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളിൽ 4 ഉം 159 പ്രോട്ടീനുകളിൽ 11 ഉം ഉൾപ്പെടെ അറിയപ്പെടുന്ന ഇന്ററാക്‌ടറുകൾ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.d LC-MS/MS തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രതിനിധി ലക്ഷ്യങ്ങൾ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി പരിശോധിച്ചു.e Ssu72, SNW1 എന്നിവ രജിസ്റ്റർ ചെയ്യാത്ത പാർക്കിൻ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു.ഈ FLAG-ടാഗ് ചെയ്‌ത പ്രോട്ടീൻ പ്ലാസ്മിഡുകൾ HEK293T, HEK293T-Parkin-miniSOG എന്നിവയിലേക്ക് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ടു, തുടർന്ന് വിവിധ സമയ പോയിന്റുകളിൽ CCCP ചികിത്സ നടത്തി.പാർക്കിൻ ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ ലൈനിലാണ് അപചയം കൂടുതൽ പ്രകടമായത്.f പ്രോട്ടീസോം ഇൻഹിബിറ്റർ MG132 ഉപയോഗിച്ച്, Ssu72, SNW1 എന്നിവയുടെ ഡീഗ്രേഡേഷൻ പ്രക്രിയ പ്രോട്ടീസോം-എല്ലായിടത്തും മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു.ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾ സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ കുറഞ്ഞത് രണ്ട് തവണയെങ്കിലും സ്വതന്ത്രമായി ആവർത്തിച്ചു.റോ ഡാറ്റ ഫയലുകളുടെ രൂപത്തിലാണ് റോ ഡാറ്റ നൽകിയിരിക്കുന്നത്.
ശ്രദ്ധേയമായി, PDPL തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രോട്ടീനുകളിൽ പാർക്കിൻ-ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളും അവയുടെ അടിവസ്ത്രങ്ങളും ഉണ്ടായിരിക്കണം.രജിസ്റ്റർ ചെയ്യാത്ത പാർക്കിൻ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞ ഏഴ് പ്രോട്ടീനുകളും (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72, SNW1) പ്ലാസ്മിഡുകളും തിരഞ്ഞെടുത്ത് ഈ ജീനുകളെ സാധാരണ HEK293T-ലേക്ക് തുറന്നുകാട്ടാൻ പ്ലാസ്മിഡുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു.Ssu72, SNW1 പ്രോട്ടീനുകളുടെ അളവ് സ്ഥിരതയുള്ള miniSOG-Parkin ലൈനിൽ (ചിത്രം 5e) ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു.12 മണിക്കൂർ സിസിസിപി ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ രണ്ട് അടിവസ്ത്രങ്ങളുടെയും ഏറ്റവും വലിയ അപചയത്തിന് കാരണമായി.Ssu72, SNW1 എന്നിവയുടെ അപചയം പ്രോട്ടീസോം-എല്ലായിടത്തും നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നുണ്ടോ എന്ന് അന്വേഷിക്കാൻ, പ്രോട്ടീസോം പ്രവർത്തനത്തെ തടയാൻ പ്രോട്ടീസോം ഇൻഹിബിറ്റർ MG132 ചേർത്തു, വാസ്തവത്തിൽ അവയുടെ ഡീഗ്രഡേഷൻ പ്രക്രിയ തടസ്സപ്പെട്ടതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 5f).വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 10) ഉപയോഗിച്ച് പാർക്കിൻ ഇന്ററാക്ടറുകളായി അധിക നോൺ-സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് ടാർഗെറ്റുകൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു, ഇത് LC-MS/MS-മായി സ്ഥിരമായ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.ഉപസംഹാരമായി, ടാർഗെറ്റ് പ്രോട്ടീൻ ട്രാൻസ്ഫെക്ഷൻ വെരിഫിക്കേഷനുമായി PDPL വർക്ക്ഫ്ലോയുടെ സംയോജനം രജിസ്റ്റർ ചെയ്യാത്ത E3 ലിഗേസ് സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ അനുവദിക്കുന്നു.
ഇടത്തിലും സമയത്തിലും ഇടപഴകുന്ന POI-കൾ തിരിച്ചറിയാൻ നിങ്ങളെ അനുവദിക്കുന്ന ഒരു പൊതു പ്രോക്‌സിമിറ്റി മാർക്കിംഗ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോം ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചിട്ടുണ്ട്.പ്ലാറ്റ്‌ഫോം മിനിഎസ്ഒജി ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസർ പ്രോട്ടീനിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്, ഇത് ഏകദേശം 12 kDa മാത്രമാണ്, മുതിർന്ന APEX2 എൻസൈമിന്റെ (27 kDa) പകുതി വലുപ്പത്തിലും TurboID- യുടെ മൂന്നിലൊന്ന് വലുപ്പത്തിലും (35 kDa).ചെറിയ വലിപ്പം ചെറിയ പ്രോട്ടീൻ ഇന്ററാറ്റോമുകൾ പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ആപ്ലിക്കേഷനുകളുടെ ശ്രേണിയെ വളരെയധികം വികസിപ്പിക്കണം.ജനിതകമായി എൻകോഡ് ചെയ്ത പ്രോട്ടീനുകളോ ചെറിയ തന്മാത്രകളോ ആകട്ടെ, അധിക ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറുകളുടെ കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം, സിംഗിൾ ഓക്സിജന്റെ ക്വാണ്ടം വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും ഈ സമീപനത്തിന്റെ സംവേദനക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും ആവശ്യമാണ്.miniSOG-യുടെ നിലവിലെ പതിപ്പിന്, പ്രോക്‌സിമിറ്റി മാർക്കറുകൾ സജീവമാക്കുന്നതിന് നീല പ്രകാശം ഉപയോഗിച്ച് ഉയർന്ന ടെമ്പറൽ റെസലൂഷൻ നേടാനാകും.കൂടാതെ, ദീർഘമായ എക്സ്പോഷർ സമയം സിംഗിൾ ഓക്സിജന്റെ ഒരു വലിയ "ക്ലൗഡ്" പുറത്തുവിടുകയും, കൂടുതൽ വിദൂര ഹിസ്റ്റിഡൈൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ പരിഷ്കരിക്കുകയും ലേബലിംഗ് റേഡിയസ് വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും PDPL സ്പേഷ്യൽ റെസല്യൂഷൻ മികച്ചതാക്കാനുള്ള കഴിവ് നൽകുകയും ചെയ്തു.സിഗ്നൽ-ടു-പശ്ചാത്തല അനുപാതം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ ഏഴ് കെമിക്കൽ പ്രോബുകൾ പരീക്ഷിക്കുകയും ഈ സമീപനത്തിന് പിന്നിലെ തന്മാത്രാ സംവിധാനം പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.TOP-ABPP വർക്ക്ഫ്ലോ സംയോജിപ്പിച്ച് പക്ഷപാതരഹിതമായ ഓപ്പൺ സെർച്ച്, പരിഷ്‌ക്കരണങ്ങൾ ഹിസ്‌റ്റിഡിനുകളിൽ മാത്രമേ സംഭവിച്ചിട്ടുള്ളൂവെന്നും ലൂപ്പ് മേഖലയിലെ ഹിസ്റ്റിഡിനുകൾക്ക് മിതമായ മുൻഗണന ഒഴികെ, വർദ്ധിച്ച ഹിസ്‌റ്റിഡിൻ പരിഷ്‌ക്കരണങ്ങൾക്കായി സ്ഥിരമായ സൂക്ഷ്മപരിസ്ഥിതി നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ലെന്നും സ്ഥിരീകരിച്ചു.
മറ്റ് പ്രോക്‌സിമിറ്റി ലേബലിംഗുമായും ഓർഗനെല്ലെ-നിർദ്ദിഷ്ട കെമിക്കൽ പ്രോബ് രീതികളുമായും താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്ന പ്രോട്ടോം സ്പെസിഫിറ്റിയും കവറേജും ഉള്ള സബ്സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടിയോമുകളെ വിശേഷിപ്പിക്കാനും PDPL ഉപയോഗിച്ചു.ഉപരിതലം, ലൈസോസോമൽ, സീക്രട്ട്-അസോസിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടിയോമുകൾ എന്നിവയെ ചിത്രീകരിക്കാനും പ്രോക്സിമിറ്റി മാർക്കറുകൾ വിജയകരമായി ഉപയോഗിച്ചു.PDPL ഈ ഉപസെല്ലുലാർ അവയവങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുമെന്ന് ഞങ്ങൾ വിശ്വസിക്കുന്നു.കൂടാതെ, മെംബ്രൻ ബൗണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളേക്കാൾ സങ്കീർണ്ണമായ സൈറ്റോസോളിക് പ്രോട്ടീൻ ബൈൻഡിംഗിനായുള്ള ടാർഗെറ്റുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിലൂടെ ഞങ്ങൾ PDPL-നെ വെല്ലുവിളിച്ചു, അവയുടെ ചലനാത്മക ഗുണങ്ങളും കൂടുതൽ താൽക്കാലിക ഇടപെടലുകളിലെ ഇടപെടലും കാരണംരണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളിൽ PDPL പ്രയോഗിച്ചു, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ കോ ആക്റ്റിവേറ്റർ BRD4, രോഗവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ലിഗേസ് E3 പാർക്കിൻ.ഈ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളും അവയുടെ അടിസ്ഥാന ജീവശാസ്ത്രപരമായ പ്രവർത്തനങ്ങൾക്ക് മാത്രമല്ല, അവയുടെ ക്ലിനിക്കൽ പ്രസക്തിക്കും ചികിത്സാ സാധ്യതകൾക്കും വേണ്ടി തിരഞ്ഞെടുത്തു.ഈ രണ്ട് POI-കൾക്കായി, അറിയപ്പെടുന്ന ബൈൻഡിംഗ് പങ്കാളികളും രജിസ്റ്റർ ചെയ്യാത്ത ലക്ഷ്യങ്ങളും തിരിച്ചറിഞ്ഞു.ശ്രദ്ധേയമായി, ഘട്ടം വേർതിരിക്കലുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീൻ SFPQ കോ-IP സ്ഥിരീകരിച്ചു, ഇത് BRD4 (ഹ്രസ്വ ഐസോഫോം) LLPS-നെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന ഒരു പുതിയ സംവിധാനത്തെ സൂചിപ്പിക്കാം.അതേ സമയം, പാർക്കിൻ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളുടെ തിരിച്ചറിയൽ പരോക്ഷ പശകളുടെ തിരിച്ചറിയൽ ആവശ്യമായ ഒരു സാഹചര്യമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ വിശ്വസിക്കുന്നു.ഞങ്ങൾ രണ്ട് അജ്ഞാത പാർക്കിൻ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകൾ തിരിച്ചറിയുകയും സർവവ്യാപന-പ്രോട്ടീസോം പാതയിലൂടെ അവയുടെ അപചയം സ്ഥിരീകരിക്കുകയും ചെയ്തു.അടുത്തിടെ, ഹൈഡ്രോലേസ് സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളെ എൻസൈമുകൾ ഉപയോഗിച്ച് കുടുക്കി കണ്ടെത്തുന്നതിന് മെക്കാനിസം അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ട്രാപ്പിംഗ് തന്ത്രം വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്.ഇത് വളരെ ശക്തമായ ഒരു രീതിയാണെങ്കിലും, വലിയ സമുച്ചയങ്ങളുടെ രൂപീകരണത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന അടിവസ്ത്രങ്ങളുടെ വിശകലനത്തിന് ഇത് അനുയോജ്യമല്ല, എൻസൈമിനും അടിവസ്ത്രത്തിനും ഇടയിലുള്ള കോവാലന്റ് ബോണ്ടുകളുടെ രൂപീകരണം ആവശ്യമാണ്.ഡീബിക്വിറ്റിനേസ്, മെറ്റലോപ്രോട്ടീസ് ഫാമിലികൾ പോലുള്ള മറ്റ് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളെയും എൻസൈം കുടുംബങ്ങളെയും പഠിക്കാൻ PDPL വിപുലീകരിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.
മെച്ചപ്പെട്ട സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ ഉൽപ്പാദനം ഉപയോഗിച്ച് SOPP3 എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന മിനിസോജിയുടെ ഒരു പുതിയ രൂപം വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്.ഞങ്ങൾ miniSOG-നെ SOPP3-മായി താരതമ്യം ചെയ്യുകയും മെച്ചപ്പെട്ട അടയാളപ്പെടുത്തൽ പ്രകടനം കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്തു, എന്നിരുന്നാലും സിഗ്നൽ-ടു-നോയ്‌സ് അനുപാതം മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു (അനുബന്ധ ചിത്രം. 11).SOPP3 ന്റെ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ (ഉദാ, ഡയറക്‌റ്റ് പരിണാമത്തിലൂടെ) കൂടുതൽ കാര്യക്ഷമമായ ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസർ പ്രോട്ടീനുകളിലേക്ക് നയിക്കുമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു, അത് കുറഞ്ഞ പ്രകാശ സമയം ആവശ്യമായി വരും, അങ്ങനെ കൂടുതൽ ചലനാത്മക സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകൾ പിടിച്ചെടുക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു.PDPL-ന്റെ നിലവിലെ പതിപ്പ് സെല്ലുലാർ പരിതസ്ഥിതിയിൽ മാത്രമായി പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധേയമാണ്, കാരണം ഇതിന് നീല വെളിച്ചം വെളിച്ചം ആവശ്യമാണ്, മാത്രമല്ല ആഴത്തിലുള്ള ടിഷ്യൂകളിലേക്ക് തുളച്ചുകയറാൻ കഴിയില്ല.ഈ സവിശേഷത മൃഗങ്ങളുടെ മാതൃകാ പഠനങ്ങളിൽ അതിന്റെ ഉപയോഗത്തെ തടയുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, ഒപ്‌ടോജെനെറ്റിക്‌സും പിഡിപിഎല്ലും ചേർന്ന് മൃഗ ഗവേഷണത്തിന്, പ്രത്യേകിച്ച് തലച്ചോറിൽ ഒരു അവസരം നൽകും.കൂടാതെ, മറ്റ് എഞ്ചിനീയറിംഗ് ഇൻഫ്രാറെഡ് ഫോട്ടോസെൻസിറ്റൈസറുകളും ഈ പരിമിതി ഇല്ലാതാക്കുന്നു.ഈ മേഖലയിൽ ഇപ്പോൾ ഗവേഷണം നടക്കുന്നുണ്ട്.
HEK293T സെൽ ലൈൻ ATCC (CRL-3216) ൽ നിന്ന് ലഭിച്ചു.മൈകോപ്ലാസ്മ അണുബാധയ്‌ക്കായി സെൽ ലൈൻ നെഗറ്റീവ് പരീക്ഷിക്കുകയും DMEM (Thermo, #C11995500BT) യിൽ സംസ്‌കരിക്കുകയും ചെയ്‌തു, 10% ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെ ബോവിന് സെറം (FBS, Vistech, #SE100-B), 1% പെൻസിലിൻ/സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (Hyclone, #SV30010).വളർന്നത്.
3-അമിനോഫെനൈലിൻ (സാമ്പിൾ 3), (4-എഥിനൈൽഫെനൈൽ) മെത്തനാമൈൻ (സാമ്പിൾ 4) എന്നിവ ബൈഡെഫാമിൽ നിന്ന് വാങ്ങിയതാണ്.Propylamine (Probe 2) എനർജി-കെമിക്കൽസിൽ നിന്ന് വാങ്ങിയതാണ്.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (Probe 1) പ്രസിദ്ധീകരിച്ച രീതികൾ അനുസരിച്ച് സമന്വയിപ്പിച്ചു.
സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 1 ഈ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന ജനിതക ഘടനകളെ പട്ടികപ്പെടുത്തുന്നു.മിനിഎസ്ഒജി, കില്ലർറെഡ് സീക്വൻസുകൾ പി.സൗവിൽ നിന്നുള്ള (പീക്കിംഗ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി) ഗിഫ്റ്റ് പ്ലാസ്മിഡിൽ നിന്നാണ് ക്ലോൺ ചെയ്തത്.COX4-ന്റെ 23 N-ടെർമിനൽ അമിനോ ആസിഡുകളിൽ നിന്ന് മൈറ്റോകോൺഡ്രിയൽ മാട്രിക്സ് ടാർഗെറ്റിംഗ് സീക്വൻസ് ഉരുത്തിരിഞ്ഞതാണ്, കൂടാതെ ഒരു ഗിബ്സൺ അസംബ്ലി (Beyotime, #D7010S) ഉപയോഗിച്ച് സൂചിപ്പിച്ച വെക്റ്ററുകളിലേക്ക് ക്ലോൺ ചെയ്തു.എൻഡോപ്ലാസ്മിക് റെറ്റിക്യുലത്തിന്റെ മെംബ്രണും ന്യൂക്ലിയസും ലക്ഷ്യമിടാൻ, HEK293T സെല്ലുകളുടെ ഒരു cDNA ലൈബ്രറിയിൽ നിന്നും PCR ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്ത SEC61B ഹ്യൂമൻ DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), കൂടാതെ H2B DNA (D. Lin, Shen, Bay Laboratory ദാനം ചെയ്തത്) മുകളിൽ സൂചിപ്പിച്ചതുപോലെ ക്ലോൺ ചെയ്തു.മറ്റുവിധത്തിൽ സൂചിപ്പിച്ചിട്ടില്ലെങ്കിൽ, സ്ഥിരതയുള്ള സെൽ ലൈനുകളുടെ കൈമാറ്റത്തിനും നിർമ്മാണത്തിനും ഉപയോഗിക്കുന്ന മറ്റ് പ്രോട്ടീൻ ജീനുകൾ HEK293T സെൽ cDNA ലൈബ്രറിയിൽ നിന്ന് PCR വർദ്ധിപ്പിക്കും.G3S (GGGS), G4S (GGGGS) എന്നിവ ബെയ്റ്റ് പ്രോട്ടീനും മിനിഎസ്ഒജിയും തമ്മിലുള്ള ലിങ്കറായി ഉപയോഗിച്ചു.ഈ ഫ്യൂഷൻ നിർമ്മിതികളിലേക്ക് ഒരു V5 എപ്പിറ്റോപ്പ് ടാഗ് (GKPIPNPLLGLDST) ചേർത്തു.സസ്തനികളിലെ ആവിഷ്‌കാരത്തിനും സ്ഥിരതയുള്ള ഒരു സെൽ ലൈൻ സ്ഥാപിക്കുന്നതിനുമായി, miniSOG ഫ്യൂഷൻ നിർമ്മിതി pLX304 ലെന്റിവൈറൽ വെക്‌ടറിലേക്ക് സബ്‌ക്ലോൺ ചെയ്‌തു.ബാക്ടീരിയൽ എക്‌സ്‌പ്രഷനുവേണ്ടി, സി-ടെർമിനസിൽ 6xHis എന്ന് ലേബൽ ചെയ്ത pET21a വെക്‌ടറിലേക്ക് മിനിSOG ക്ലോൺ ചെയ്തു.
HEK293T സെല്ലുകൾ ആറ് കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ ഒരു കിണറിന് 2.0 x 105 സെല്ലുകൾ വിത്ത് വിതയ്ക്കുകയും 24 മണിക്കൂറിന് ശേഷം റീകോമ്പിനന്റ് ലെന്റിവൈറൽ പ്ലാസ്മിഡുകളും (2.4 μg pLX304) വൈറൽ പാക്കേജിംഗ് പ്ലാസ്മിഡുകളും (1.5 μg psPAX2, 1.2po.G0μg ഉപയോഗിച്ച് പി. , #C0533), ഏകദേശം 80% സംയോജനം.ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് കൈമാറ്റം ചെയ്ത ശേഷം, മീഡിയം മാറ്റി മറ്റൊരു 24 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.24, 48, 72 മണിക്കൂറുകൾക്ക് ശേഷമാണ് വൈറസിന്റെ ശേഖരണം നടത്തിയത്.ടാർഗെറ്റ് സെൽ ലൈനുകളുടെ അണുബാധയ്ക്ക് മുമ്പ്, വൈറൽ മീഡിയം 0.8 μm ഫിൽട്ടർ (Merck, #millex-GP) വഴി ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും പോളിബ്രീൻ (Solarbio, #H8761) 8 μg/ml എന്ന സാന്ദ്രതയിലേക്ക് ചേർക്കുകയും ചെയ്തു.24 മണിക്കൂറിന് ശേഷം, മീഡിയം മാറ്റി കോശങ്ങൾ വീണ്ടെടുക്കാൻ അനുവദിച്ചു.5 μg/ml ബ്ലാസ്റ്റിസിഡിൻ (Solarbio, #3513-03-9) ഉപയോഗിച്ചാണ് സെല്ലുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തത്, ആദ്യ മൂന്ന് പാസേജുകൾക്കായി കുറഞ്ഞ കർശനമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പായി.അടുത്ത മൂന്ന് ഖണ്ഡികകൾക്കായി 20 μg/ml കൂടുതൽ കർശനമായ വ്യവസ്ഥയായി ഉപയോഗിച്ചു.
ഒരു കിണറിന് ഏകദേശം 20,000 സെല്ലുകളുടെ സാന്ദ്രതയിൽ 12 കിണർ അറകളിൽ (Ibidi, #81201) കോശങ്ങൾ വിതച്ചു.HEK293T സെല്ലുകളുടെ അഡീഷൻ മെച്ചപ്പെടുത്താൻ, 50 µg/ml ഫൈബ്രോനെക്റ്റിൻ (കോർണിംഗ്, #356008) ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർഡ് സലൈനിൽ (PBS, Sangon, #B640435) 37°C-ൽ ലയിപ്പിച്ചത് ചേർക്കുക.അറകൾ 1 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് ചികിത്സിക്കുകയും പിന്നീട് പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് നീക്കം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.24 മണിക്കൂറിന് ശേഷം, സെല്ലുകൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് ഒരിക്കൽ കഴുകി, 1 mM പ്രോബ് 3 ഉപയോഗിച്ച് ഫ്രഷ് ഹാങ്ക്‌സിന്റെ ബാലൻസ്ഡ് ഉപ്പ് ലായനിയിൽ (HBSS, Gibco, #14025092) 37 ° C താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് ഒരു നീല LED (460 nm) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ).) ഊഷ്മാവിൽ 10 മിനിറ്റ് വികിരണം ചെയ്തു.അതിനുശേഷം, കോശങ്ങൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് രണ്ടുതവണ കഴുകി, 4% ഫോർമാൽഡിഹൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് PBS (Sangon, #E672002) 15 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ ഉറപ്പിച്ചു.പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് മൂന്ന് തവണ കഴുകി അധിക ഫോർമാൽഡിഹൈഡ് ഫിക്സഡ് സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്തു.പിന്നീട് PBS-ൽ 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) ഉപയോഗിച്ച് സെല്ലുകൾ പെർമെബിലൈസ് ചെയ്യുകയും PBS ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകുകയും ചെയ്തു.തുടർന്ന് ചേമ്പർ നീക്കം ചെയ്‌ത് ഓരോ സാമ്പിളിലേക്കും 50 µM Cy3-azide (അലാഡിൻ, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) അടങ്ങിയ ഒരു ക്ലിക്ക് റിയാക്ഷൻ മിശ്രിതത്തിന്റെ 25 µl ചേർക്കുക. കൂടാതെ 0.5 mg/ml സോഡിയം അസ്കോർബേറ്റും (അലാഡിൻ, നമ്പർ S105024) ഊഷ്മാവിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുന്നു.ഒരു സ്നാപ്പ് പ്രതികരണത്തിന് ശേഷം, 0.05% ട്വീൻ-20 (സാങ്കോൺ, #A600560) (PBST) അടങ്ങിയ PBS ഉപയോഗിച്ച് സെല്ലുകൾ ആറ് തവണ കഴുകി, തുടർന്ന് ഊഷ്മാവിൽ 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് PBST-യിൽ 5% BSA (Abcone, #B24726) ഉപയോഗിച്ച് തടഞ്ഞു.
കൊളോക്കലൈസേഷൻ ഇമ്മ്യൂണോസ്റ്റൈനിംഗിനായി, സൂചിപ്പിച്ച വ്യവസ്ഥകൾക്കനുസരിച്ച് കോശങ്ങൾ പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു: മൗസ് ആന്റി-വി5 ടാഗ് mAb (1:500, CST, #80076), റാബിറ്റ് ആന്റി-എച്ച്എസ്പി60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), റാബിറ്റ് പോളിക്ലോണൽ ആന്റി-കാൽനെക്‌സിൻ ആന്റിബോഡി (1:500, Abcam, #ab22595) അല്ലെങ്കിൽ റാബിറ്റ് ആന്റി-ലാമിൻ A/C മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (1:500; CST, #2032) രാത്രിയിൽ 4 °C.PBST ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകിയ ശേഷം, കോശങ്ങൾ ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റുചെയ്‌തു: ആട് ആന്റി-റാബിറ്റ് അലക്‌സാ ഫ്‌ളൂർ 488 (തെർമോ, #A11034) 1:1000 നേർപ്പിച്ചു, ആട് ആന്റി-മൗസ് അലക്സാ ഫ്‌ളൂർ 594 (CST, #8889) 00001 ലയിപ്പിച്ചു.നേർപ്പിക്കൽ ഊഷ്മാവിൽ 30 മിനിറ്റ് നേർപ്പിക്കുക.സെല്ലുകൾ PBST ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകി, ഊഷ്മാവിൽ 10 മിനിറ്റ് PBS-ൽ DAPI (Thermo, #D1306) ഉപയോഗിച്ച് കൌണ്ടർസ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു.PBS ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകിയ ശേഷം, ചിത്രീകരണത്തിനായി PBS-ൽ 50% ഗ്ലിസറോളിൽ (Sangon, #A600232) സെല്ലുകൾ അടച്ചു.ZEISS LSM 900 Airyscan2 കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പും ZNE 3.5 സോഫ്‌റ്റ്‌വെയറും ഉപയോഗിച്ചാണ് ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെന്റ് ചിത്രങ്ങൾ ലഭിച്ചത്.
സിംഗിൾ ഓക്സിജൻ ഫ്ലൂറസന്റ് ഇമേജിംഗിനായി, ഹാങ്ക്സ് HEPES ബഫറിൽ (DOJINDO, #MT05) 100 nM Si-DMA ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ഹാങ്ക്സ് HEPES ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങൾ രണ്ടുതവണ കഴുകി.പ്രകാശം എക്സ്പോഷർ ചെയ്ത ശേഷം, കോശങ്ങൾ CO2 ഇൻകുബേറ്ററിൽ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 45 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.പിന്നീട് ഹാങ്‌ക്‌സിന്റെ HEPES ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങൾ രണ്ടുതവണ കഴുകി, ഹാങ്‌ക്‌സിന്റെ HEPES ബഫറിൽ Hoechst ഉപയോഗിച്ച് 10 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ ഘടിപ്പിക്കുകയും ZEISS LSM 900 കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുകയും ചെയ്തു., #M36008) കാൽസ്യവും മഗ്നീഷ്യവും അടങ്ങിയ HBSS ബഫറിൽ.ലൈറ്റ് അല്ലെങ്കിൽ ഡോക്‌സോറൂബിസിൻ (MCE, #HY-15142A) എക്സ്പോഷർ ചെയ്ത ശേഷം, കോശങ്ങൾ CO2 ഇൻകുബേറ്ററിൽ 37 ° C. 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും HBSS ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് രണ്ടുതവണ കഴുകുകയും ഊഷ്മാവിൽ HBSS ബഫറിൽ Hoechst ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.മിനിറ്റ്.30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 1% BSA അടങ്ങിയ HBSS-ൽ 20 μM ഡോക്‌സോറൂബിസിൻ ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങളെ ചികിത്സിക്കുന്ന പോസിറ്റീവ് പ്രോബ് കൺട്രോളായി ഡോക്‌സോറൂബിസിൻ ഉപയോഗിച്ചു.Zeiss LSM 900 കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ചാണ് ഇമ്മ്യൂണോഫ്ലൂറസെന്റ് ചിത്രങ്ങൾ ലഭിച്ചത്.
HEK293T സെല്ലുകൾ mito-miniSOG സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന 15 സെന്റീമീറ്റർ പാത്രങ്ങളിൽ ഏകദേശം 30% സാന്ദ്രതയിൽ വിത്തുപാകി.48 മണിക്കൂറിന് ശേഷം, ~80% സംഗമം എത്തിയപ്പോൾ, സെല്ലുകൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് ഒരിക്കൽ കഴുകി, 1 mM പ്രോബ് 3 ഉപയോഗിച്ച് പുതിയ HBSS ബഫറിൽ 1 മണിക്കൂർ 37°C താപനിലയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും തുടർന്ന് മുറിയിൽ 10 മിനിറ്റ് നീല LED ഉപയോഗിച്ച് പ്രകാശിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു. താപനില..അതിനുശേഷം, സെല്ലുകൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് രണ്ടുതവണ കഴുകി, EDTA-ഫ്രീ പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ (MCE, #HY-K0011) അടങ്ങിയ ഐസ്-കോൾഡ് പിബിഎസ് ബഫറിൽ സ്ക്രാപ്പ് ചെയ്യുകയും വീണ്ടും നൽകുകയും ചെയ്തു.1 മിനിറ്റ് (1 സെക്കൻഡ് ഓൺ, 35% ആംപ്ലിറ്റ്യൂഡിൽ 1 സെക്കൻഡ് ഓഫ്) ടിപ്പ് സോണിക്കേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് സെല്ലുകൾ ലൈസ് ചെയ്തു.തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന മിശ്രിതം അവശിഷ്ടങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 15,871 xg-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു, കൂടാതെ ഒരു BCA പ്രോട്ടീൻ അസ്സെ കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സൂപ്പർനാറ്റന്റ് കോൺസൺട്രേഷൻ 4 mg/mL ആയി ക്രമീകരിച്ചു (Beyotime, #P0009).മേൽപ്പറഞ്ഞ ലൈസേറ്റിന്റെ 1 മില്ലി 0.1 mM ഫോട്ടോഡിഗ്രേഡബിൾ ബയോട്ടിൻ അസൈഡ് (കോൺഫ്ലൂർ, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ലിഗാൻഡ് (അലാഡിൻ, #T162437), അടിയിൽ 1 mcubator എന്നിവയുമായി സംയോജിപ്പിക്കുക. ഊഷ്മാവിൽ 1 മണിക്കൂർ ഭ്രമണം.ഒരു സ്‌നാപ്പ് പ്രതികരണത്തിന് ശേഷം, മിശ്രിതം 10 മില്ലി ഗ്ലാസ് പാത്രത്തിൽ പ്രീ-മിക്‌സ്ഡ് ലായനിയിൽ ചേർക്കുക (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml).സാമ്പിളുകൾ മിക്സഡ് ചെയ്ത് 4500 ഗ്രാം ഊഷ്മാവിൽ 10 മിനിറ്റ് സെന്റീഫ്യൂജ് ചെയ്തു.താഴെയുള്ളതും മുകളിലുള്ളതുമായ ലായനികൾ നിരസിച്ചു, അവശിഷ്ടം 1 മില്ലി മെഥനോൾ ഉപയോഗിച്ച് രണ്ടുതവണ കഴുകി, 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 15871 × ഗ്രാം സെന്റിഫ്യൂജ് ചെയ്തു.25 എംഎം അമോണിയം ബൈകാർബണേറ്റിൽ (ABC, അലാഡിൻ, നമ്പർ A110539) 8 M യൂറിയ (അലാഡിൻ, നമ്പർ U111902) 1 മില്ലി ചേർക്കുക.സാമ്പിളുകൾ 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) ഉപയോഗിച്ച് 40 മിനിറ്റ് 55 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ പുനർനിർമ്മിച്ചു, തുടർന്ന് 15 mM ഫ്രഷ് അയോഡോസെറ്റാമൈഡ് (Sangon, #A600539) ഇരുട്ടിലെ ഊഷ്മാവിൽ ചേർത്തു.30 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ആൽക്കൈലേഷൻ..പ്രതികരണം നിർത്താൻ 5 എംഎം ഡിത്തിയോത്രൈറ്റോൾ അധികമായി ചേർത്തു.ഓരോ സാമ്പിളിനും ഏകദേശം 100 µl ന്യൂട്രാവിഡിൻ അഗറോസ് മുത്തുകൾ (തെർമോ, #29202) തയ്യാറാക്കുക, 1 മില്ലി പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകുക.മേൽപ്പറഞ്ഞ പ്രോട്ടിയോം ലായനി 5 മില്ലി പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് നേർപ്പിച്ച് റൂം ടെമ്പറേച്ചറിൽ 4 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് കഴുകിയ ന്യൂട്രാവിഡിൻ അഗറോസ് ബീഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.മുത്തുകൾ 0.2% SDS (Sangon, #A600485) അടങ്ങിയ 5 ml PBS ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണയും 1M യൂറിയ അടങ്ങിയ 5 ml PBS ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണയും 5 ml ddH2O ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണയും കഴുകി.മുത്തുകൾ സെന്റീഫ്യൂഗേഷൻ വഴി വിളവെടുക്കുകയും 1 M യൂറിയ, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228), 20 ng/μl ട്രൈപ്സിൻ (Promega, #V5280) എന്നിവ അടങ്ങിയ 25 mM ABC യുടെ 200 μl-ൽ വീണ്ടും നൽകുകയും ചെയ്തു.ഭ്രമണത്തോടെ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ട്രൈപ്സിനൈസ് ചെയ്യുക.pH 2-3 എത്തുന്നതുവരെ ഫോർമിക് ആസിഡ് (തെർമോ, # A117-50) ചേർത്ത് പ്രതികരണം നിർത്തി.മുത്തുകൾ 0.2% എസ്ഡിഎസ് അടങ്ങിയ 1 മില്ലി പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണയും 1 എം യൂറിയ അടങ്ങിയ 1 മില്ലി പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണയും പിന്നീട് 1 മില്ലി വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളം ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണയും കഴുകി.70% MeOH ന്റെ 200 μl ഉപയോഗിച്ച് 90 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് ലൈറ്റ് ലിസിസ് (365 nm) വഴി പരിഷ്കരിച്ച പെപ്റ്റൈഡുകൾ പുറത്തിറക്കി.സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷന് ശേഷം, സൂപ്പർനാറ്റന്റ് ശേഖരിച്ചു.മുത്തുകൾ 70% MeOH ന്റെ 100 μl ഉപയോഗിച്ച് ഒരിക്കൽ കഴുകുകയും സൂപ്പർനാറ്റന്റുകൾ പൂൾ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.സാമ്പിളുകൾ ഒരു സ്പീഡ്വാക് വാക്വം കോൺസെൻട്രേറ്ററിൽ ഉണക്കി, വിശകലനം വരെ -20 ° C ൽ സംഭരിച്ചു.
സിംഗിൾ ഓക്‌സിജൻ പരിഷ്‌ക്കരിച്ച പെപ്റ്റൈഡുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിനും അളക്കുന്നതിനും, 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡിൽ സാമ്പിളുകൾ വീണ്ടും ലയിപ്പിക്കുകയും 1 μg പെപ്റ്റൈഡുകൾ ട്യൂണിൽ നിന്നുള്ള നാനോ ESI ഉറവിടവും വെണ്ടർ സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ 4-ൽ നിന്നുള്ള Xcalibur-ഉം ഘടിപ്പിച്ച Orbitrap Fusion Lumos Tribrid മാസ് സ്പെക്‌ട്രോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.3 µm C18 മെറ്റീരിയൽ (ReproSil-pur, #r13.b9.) ഉപയോഗിച്ച് 75 µm × 15 സെന്റീമീറ്റർ ആന്തരികമായി പാക്ക് ചെയ്ത കാപ്പിലറി കോളത്തിൽ സാമ്പിളുകൾ വേർതിരിച്ച് ഒരു EASY-nLC 1200 UHPLC സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് (തെർമോ) ബന്ധിപ്പിച്ചു.പെപ്റ്റൈഡുകളെ ലീനിയർ 95 മിനിറ്റ് ഗ്രേഡിയന്റ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിക്കുന്നത് 8% ലായക ബി മുതൽ 50% ലായക ബി വരെ (വെള്ളത്തിൽ A = 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡ്, 80% അസെറ്റോണിട്രൈലിൽ B = 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡ്), തുടർന്ന് രേഖീയമായി 98% B മിനിറ്റായി ഉയർത്തി. 300 nl/min എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റിൽ 6 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ.Orbitrap Fusion Lumos ഡാറ്റയെ ആശ്രയിച്ച് പൂർണ്ണ MS സ്കാനിനും MS2 സ്കാനിനും ഇടയിൽ മാറിമാറി ഡാറ്റ ശേഖരിക്കുന്നു.സ്‌പട്ടറിംഗ് വോൾട്ടേജ് 2.1 കെവി ആയി സജ്ജീകരിച്ചു, അയോൺ ട്രാൻസ്പോർട്ട് കാപ്പിലറിയുടെ താപനില 320 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസാണ്.MS സ്പെക്ട്ര (350-2000 m/z) 120,000, AGC 4 × 105, പരമാവധി ഇൻപുട്ട് സമയം 150 ms എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ശേഖരിച്ചു.ഓരോ പൂർണ്ണ സ്കാനിലും ഏറ്റവും സാധാരണമായ 10 ഗുണിത ചാർജ്ഡ് മുൻഗാമികൾ എച്ച്സിഡി ഉപയോഗിച്ച് 30% നോർമലൈസ്ഡ് കൂട്ടിയിടി ഊർജ്ജം, 1.6 m/z ക്വാഡ്രുപോൾ ഐസൊലേഷൻ വിൻഡോ, 30,000 റെസലൂഷൻ ക്രമീകരണം എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് വിഘടിപ്പിച്ചു.5×104, പരമാവധി ഇൻപുട്ട് സമയം 150 എംഎസ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ടാൻഡം മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിക്ക് ഒരു AGC ലക്ഷ്യം.ഡൈനാമിക് ഒഴിവാക്കൽ 30 സെക്കൻഡായി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു. അസൈൻ ചെയ്യാത്ത അയോണുകൾ അല്ലെങ്കിൽ 1+, >7+ ചാർജുള്ളവ MS/MS-ന് നിരസിക്കപ്പെട്ടു. അസൈൻ ചെയ്യാത്ത അയോണുകൾ അല്ലെങ്കിൽ 1+, >7+ ചാർജുള്ളവ MS/MS-ന് നിരസിക്കപ്പെട്ടു. 1+ അല്ലെങ്കിൽ 1+ കൂടാതെ >7+ ബൈലി ഓട്ട്‌ക്ലോണുകൾ വരെ എംസി/എംഎസ്. അസൈൻ ചെയ്യാത്ത അയോണുകൾ അല്ലെങ്കിൽ 1+, >7+ ചാർജുള്ള അയോണുകൾ MS/MS-ന് നിരസിക്കപ്പെട്ടു.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 1+ അല്ലെങ്കിൽ 1+ കൂടാതെ >7+ ബൈലി ഓട്ട്‌ക്ലോണുകൾ വരെ എം‌എസ്‌എസ്/എംഎസ്. MS/MS-ന് 1+, >7+ എന്നീ നിരക്കുകളുള്ള അയോണുകൾ അല്ലെങ്കിൽ അയോണുകൾ നിരസിക്കപ്പെട്ടു.
MSFragger അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള FragPipe കമ്പ്യൂട്ടിംഗ് പ്ലാറ്റ്ഫോം ഉപയോഗിച്ചാണ് അസംസ്കൃത ഡാറ്റ പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുന്നത്.-150 മുതൽ 500 Da വരെയുള്ള മുൻഗാമി മാസ് ടോളറൻസ് ഉള്ള ഒരു ഓപ്പൺ സെർച്ച് അൽഗോരിതം ഉപയോഗിച്ച് മാസ് ബയസുകളും അനുബന്ധ അമിനോ ആസിഡുകളും നിർണ്ണയിച്ചു.പിഡിയിൽ +229.0964, +247.1069 Da (പ്രോട്ടോം ഡിസ്കവർ 2.5, തെർമോ) എന്നിവയുടെ മാസ് നേട്ടങ്ങളോടെ ഹിസ്റ്റിഡിൻ പരിഷ്ക്കരണങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് പരിഷ്കരിച്ച പെപ്റ്റൈഡുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു.
സംയോജിപ്പിച്ച miniSOG ജീൻ സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കോശങ്ങൾ 6 സെന്റീമീറ്റർ പാത്രങ്ങളിൽ പൂശിയിരിക്കുന്നു.~80% സംഗമസ്ഥാനത്ത് എത്തിയപ്പോൾ, HBSS (Gibco, #14025092) ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങൾ ഒരിക്കൽ കഴുകി, പിന്നീട് HBSS-ൽ 1 മണിക്കൂർ 37°C താപനിലയിൽ കെമിക്കൽ പ്രോബുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും നീല വെളിച്ചം കൊണ്ട് പ്രകാശിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.ഊഷ്മാവിൽ 20 മിനിറ്റ് 10W LED.PDPL-ൽ ഏത് തരം റിയാക്ടീവ് ഓക്സിജൻ സ്പീഷീസാണ് ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതെന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ, 0.5 mM വിറ്റാമിൻ സി (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (സിഗ്മ, #7789-20-0) , 100 എംഎം മാനിറ്റോൾ (എനർജി കെമിക്കൽ, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 എന്നിവ കോശങ്ങളിലേക്ക് സപ്ലിമെന്റുകളായി ചേർത്തു.തണുത്ത PBS ഉപയോഗിച്ച് കഴുകിയ ശേഷം, കോശങ്ങൾ ചുരണ്ടുകയും, 1.5 മില്ലി സെന്റീഫ്യൂജ് ട്യൂബുകളിൽ ശേഖരിക്കുകയും, EDTA ഇല്ലാതെ 1x പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് 200 μl PBS-ൽ 1 മിനിറ്റ് ഒരു നുറുങ്ങ് ഉപയോഗിച്ച് സോണിക്കേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു (1 സെ, 1 സെ ഇല്ലാതെ, ആംപ്ലിറ്റ്യൂഡ് 35%).തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന മിശ്രിതം 15,871 × g-ൽ 10 മിനിറ്റ് 4 °C-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ഒരു BCA പ്രോട്ടീൻ അസ്സെ കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സൂപ്പർനാറ്റന്റ് കോൺസൺട്രേഷൻ 1 mg/mL ആയി ക്രമീകരിക്കുകയും ചെയ്തു.മേൽപ്പറഞ്ഞ ലൈസേറ്റിന്റെ ഏകദേശം 50 µl 0.1 mM റോഡാമൈൻ അസൈഡ് (അലാഡിൻ, നമ്പർ T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ലിഗാൻഡ്, 1 mM CuSO4 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 1 മണിക്കൂർ ഊഷ്മാവിൽ താഴെ നിന്ന് മുകളിലേക്ക് ഭ്രമണം ചെയ്തു.ക്ലിക്ക് പ്രതികരണത്തിന് ശേഷം, സാമ്പിളുകളിൽ 250 μl പ്രീ-ശീതീകരിച്ച അസെറ്റോൺ ചേർത്ത്, -20 ° C-ൽ 20 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും 4 ° C-ൽ 10 മിനിറ്റ് 6010×g-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തുകൊണ്ട് അസെറ്റോണിനൊപ്പം മഴ പെയ്യുന്നു.ഉരുളകൾ ശേഖരിച്ച് 50 µl 1x Laemmli ബഫറിൽ 10 മിനിറ്റ് 95 °C തിളപ്പിക്കുക.പിന്നീട് SDS-PAGE നീളമുള്ള ജെല്ലുകളിൽ സാമ്പിളുകൾ വിശകലനം ചെയ്യുകയും ഇമേജ് ലാബ് ടച്ച് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് ബയോ-റാഡ് കെമിഡോക് എംപി ടച്ച് ഇമേജിംഗ് സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുകയും ചെയ്തു.
റീകോമ്പിനന്റ് miniSOG-6xHis പ്രോട്ടീന്റെ പ്രകടനവും ശുദ്ധീകരണവും മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ നടത്തി.ചുരുക്കത്തിൽ, E. coli BL21(DE3) സെല്ലുകൾ (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis ഉപയോഗിച്ച് രൂപാന്തരപ്പെടുത്തി, പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168) ഉപയോഗിച്ച് പ്രേരിപ്പിച്ചു.സെൽ ലിസിസിന് ശേഷം, പ്രോട്ടീനുകൾ Ni-NTA അഗറോസ് ബീഡ്സ് (MCE, നമ്പർ 70666) ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിച്ചു, PBS-ന് എതിരെ ഡയാലിസ് ചെയ്ത് –80°C-ൽ സംഭരിച്ചു.
ആന്റിബോഡി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഇൻ വിട്രോ ലേബൽ പ്രോക്‌സിമിറ്റി അസ്സേയ്‌ക്കായി, 100 μM ശുദ്ധീകരിച്ച miniSOG, 1 mM പ്രോബ് 3, 1 μg ആന്റി ലേബൽ മൗസ് മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (TransGen, #HT501-01) എന്നിവ PBS-ൽ 50 μl എന്ന മൊത്തം പ്രതിപ്രവർത്തന വോളിയത്തിലേക്ക് മിക്സ് ചെയ്യുക..പ്രതിപ്രവർത്തന മിശ്രിതം ഊഷ്മാവിൽ 0, 2, 5, 10, 20 മിനിറ്റ് നീല LED ലൈറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് വികിരണം ചെയ്തു.മിശ്രിതം 0.1 mM ബയോട്ടിൻ-PEG3-azide (അലാഡിൻ, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ലിഗാൻഡ്, 1 mM CuSO4 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഊഷ്മാവിൽ 1 മണിക്കൂറിന് മുകളിലേക്കുള്ള ചലന ഷേക്കറിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.ഒരു സ്നാപ്പ് പ്രതികരണത്തിന് ശേഷം, മിശ്രിതത്തിലേക്ക് നേരിട്ട് 4x Laemmli ബഫർ ചേർത്ത് 95 ° C യിൽ 10 മിനിറ്റ് തിളപ്പിക്കുക.SDS-PAGE ജെല്ലുകളിൽ സാമ്പിളുകൾ വിശകലനം ചെയ്യുകയും സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) ഉപയോഗിച്ച് വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
സി-ടെർമിനൽ അമിഡേഷൻ (LHDALDAK-CONH2) ഉള്ള ഒരു ഹിസ്റ്റിഡിൻ അടങ്ങിയ സിന്തറ്റിക് പെപ്റ്റൈഡ് അടുത്തുള്ള പെപ്റ്റൈഡ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഇൻ വിട്രോ ലേബലിംഗ് വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിച്ചു.ഈ പരിശോധനയിൽ, 100 μM ശുദ്ധീകരിച്ച miniSOG, 10 mM പ്രോബ് 3, 2 μg/ml സിന്തറ്റിക് പെപ്റ്റൈഡ് എന്നിവ PBS-ൽ മൊത്തം 50 μl പ്രതികരണ അളവിൽ കലർത്തി.പ്രതികരണ മിശ്രിതം ഊഷ്മാവിൽ 1 മണിക്കൂർ നീല LED ലൈറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് വികിരണം ചെയ്തു.ഒരു LC-MS സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് ഒരു മൈക്രോലിറ്റർ സാമ്പിൾ വിശകലനം ചെയ്തു (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer with MassLynx spectrum analysis software).
മിനിസോഗ് ഫ്യൂഷൻ ജീൻ സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന HEK293T സെല്ലുകൾ വ്യത്യസ്ത ഓർഗനെൽ ലോക്കലൈസേഷനുള്ള (മിറ്റോ, ഇആർ, ന്യൂക്ലിയസ്) ലൈനുകൾക്കായി 10 സെന്റീമീറ്റർ പാത്രങ്ങളിലും പാർക്കിൻ-മിനിഎസ്ഒജി, ബിആർഡി4-മിനിഎസ്ഒജി ലൈനുകൾക്കായി 15 സെന്റീമീറ്റർ പാത്രങ്ങളിലും സീഡ് ചെയ്തു.~90% സംഗമസ്ഥാനത്ത് എത്തുമ്പോൾ, സെല്ലുകൾ HBSS ഉപയോഗിച്ച് ഒരിക്കൽ കഴുകി, പിന്നീട് HBSS-ൽ പ്രോബ് 3 ഉപയോഗിച്ച് 37°C-ൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ഊഷ്മാവിൽ 10 W നീല LED ഉപയോഗിച്ച് പ്രകാശിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.പാർക്കിൻ നോൺ-കോൺടാക്റ്റ് ലേബലിംഗിനായി, HBSS-ലെ പ്രോബ് 3 ഉള്ള 10 µM പ്രോട്ടോൺ കാർബോണൈൽ സയനൈഡ് കാരിയർ m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) 1 മണിക്കൂർ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ചേർത്തു.സെൽ ലിസിസ്, ക്ലിക്ക് കെമിസ്ട്രി, റിഡക്ഷൻ, ആൽക്കൈലേഷൻ ഘട്ടങ്ങൾ എന്നിവ മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ തന്നെയായിരുന്നു, ഫോട്ടോഡിഗ്രേഡബിൾ ബയോട്ടിൻ അസൈഡിന് പകരം 2 മില്ലിഗ്രാം ലൈസേറ്റ് ചേർക്കുകയും ബയോട്ടിൻ PEG3 അസൈഡ് ക്ലിക്ക് റിയാക്ഷനിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു എന്നതൊഴിച്ചാൽ.സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ ശേഷം, മുത്തുകൾ 0.2% എസ്ഡിഎസ് അടങ്ങിയ 5 മില്ലി പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണയും, 1 എം യൂറിയ അടങ്ങിയ 5 മില്ലി പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണയും, 5 മില്ലി പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണയും കഴുകി.അതിനുശേഷം, 300 µl 25 mM എബിസിയിൽ 1 M യൂറിയ അടങ്ങിയ 2 µg ട്രിപ്സിൻ ചേർത്തു, 37°C താപനിലയിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് പ്രോട്ടീൻ പിളർന്നു.2-3 pH എത്തുന്നതുവരെ ഫോർമിക് ആസിഡ് ചേർത്ത് പ്രതികരണം നിർത്തി.മുത്തുകളിൽ ട്രൈപ്സിനൈസേഷനുശേഷം, പെപ്റ്റൈഡ് ലായനി ഒരു SOLAµ HRP കോളം (തെർമോ, #60209-001) ഉപയോഗിച്ച് ഡീസൽഡ് ചെയ്യുകയും ഒരു സ്പീഡ്വാക് വാക്വം കോൺസെൻട്രേറ്ററിൽ ഉണക്കുകയും ചെയ്തു.0.1% ഫോർമിക് ആസിഡിൽ പെപ്റ്റൈഡുകൾ വീണ്ടും ലയിപ്പിക്കുകയും 500 ng പെപ്റ്റൈഡുകൾ മുകളിൽ വിവരിച്ച നാനോ-ഇഎസ്ഐ ഉറവിടം ഘടിപ്പിച്ച Orbitrap Fusion Lumos Tribrid മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.വാണിജ്യ ആർ‌പി-എച്ച്‌പി‌എൽ‌സി മുൻ‌കോളങ്ങളിലും (75 μm x 2 സെന്റീമീറ്റർ) (തെർമോ, നമ്പർ 164946), അനലിറ്റിക്കൽ ആർ‌പി-എച്ച്‌പി‌എൽ‌സി നിരകളിലും (75 μm x 25 സെന്റീമീറ്റർ) (തെർമോ, നമ്പർ 164941) പെപ്റ്റൈഡുകൾ വേർതിരിക്കുന്നു, രണ്ടും 2 μm കൊണ്ട് നിറഞ്ഞിരിക്കുന്നു.60 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ഗ്രേഡിയന്റ് 8% മുതൽ 35% വരെ ACN, തുടർന്ന് 300 Nl/min എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റിൽ 6 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ രേഖീയമായി 98% B ആയി വർദ്ധിച്ചു.MS സ്പെക്ട്ര (350-1500 m/z) 60,000, AGC 4 × 105, പരമാവധി ഇൻപുട്ട് സമയം 50 ms എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ശേഖരിച്ചു.തിരഞ്ഞെടുത്ത അയോണുകൾ 3 സെക്കൻഡ് സൈക്കിളുകളിൽ എച്ച്‌സിഡി ഉപയോഗിച്ച് 30% നോർമലൈസ്ഡ് കൂട്ടിയിടി ഊർജ്ജം, 1.6 m/z ക്വാഡ്രുപോൾ ഐസൊലേഷൻ വിൻഡോ, 15000 റെസല്യൂഷൻ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് വിഘടിപ്പിച്ചു. 22 എംഎസ് ഉപയോഗിച്ചു.ഡൈനാമിക് ഒഴിവാക്കൽ 45 സെക്കൻഡായി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു. അസൈൻ ചെയ്യാത്ത അയോണുകൾ അല്ലെങ്കിൽ 1+, >7+ ചാർജുള്ളവ MS/MS-ന് നിരസിക്കപ്പെട്ടു. അസൈൻ ചെയ്യാത്ത അയോണുകൾ അല്ലെങ്കിൽ 1+, >7+ ചാർജുള്ളവ MS/MS-ന് നിരസിക്കപ്പെട്ടു. 1+ അല്ലെങ്കിൽ 1+ കൂടാതെ >7+ ബൈലി ഓട്ട്‌ക്ലോണുകൾ വരെ എംസി/എംഎസ്. അസൈൻ ചെയ്യാത്ത അയോണുകൾ അല്ലെങ്കിൽ 1+, >7+ ചാർജുള്ള അയോണുകൾ MS/MS-ന് നിരസിക്കപ്പെട്ടു.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 1+ അല്ലെങ്കിൽ 1+ കൂടാതെ >7+ ബൈലി ഓട്ട്‌ക്ലോണുകൾ വരെ എം‌എസ്‌എസ്/എംഎസ്. MS/MS-ന് 1+, >7+ എന്നീ നിരക്കുകളുള്ള അയോണുകൾ അല്ലെങ്കിൽ അയോണുകൾ നിരസിക്കപ്പെട്ടു.
NeutrAvidin മുത്തുകളുടെ സമ്പുഷ്ടീകരണം വരെയുള്ള സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കൽ ഘട്ടങ്ങൾ മുകളിൽ വിവരിച്ച LC-MS/MS വിശകലനത്തിലെ പോലെ തന്നെയായിരുന്നു.ലോഡിംഗ് നിയന്ത്രണത്തിനായി ഏകദേശം 50 μg ലൈസേറ്റ് ഇൻപുട്ടായി ഉപയോഗിച്ചു, കൂടാതെ ക്ലിക്ക് പ്രതികരണങ്ങൾക്കായി 2 മില്ലിഗ്രാം ലൈസേറ്റ് ഉപയോഗിച്ചു.ന്യൂട്രാവിഡിൻ ഉപയോഗിച്ച് സമ്പുഷ്ടമാക്കുകയും കഴുകുകയും ചെയ്ത ശേഷം, അഗറോസ് റെസിൻ ബീഡുകളിലേക്ക് 50 μl ലാംലിയുടെ ബഫർ ചേർത്ത് 95 ° C. താപനിലയിൽ 5 മിനിറ്റ് തിളപ്പിച്ച് ബന്ധിപ്പിച്ച പ്രോട്ടീനുകൾ ഇല്ലാതാക്കി.കൺട്രോൾ ലോഡ് ഇൻപുട്ടും ബീഡ് സമ്പുഷ്ടമാക്കിയ സാമ്പിളുകളും SDS-PAGE വിശകലനം ചെയ്യുകയും സാധാരണ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് രീതികൾ വഴി PVDF മെംബ്രണുകളിലേക്ക് (Millipore, #ISEQ00010) കൈമാറുകയും ചെയ്തു.0.1% ട്വീൻ-20 (ടിബിഎസ്ടി) അടങ്ങിയ ടിബിഎസിൽ 5% സ്കിം മിൽക്ക് (സാങ്കോൺ, #A600669) ഉപയോഗിച്ച് സ്തരങ്ങൾ തടയുകയും പ്രാഥമിക, ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് തുടർച്ചയായി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.ടിബിഎസ്ടിയിൽ 5% കൊഴുപ്പ് നീക്കിയ പാലിൽ 1:1000 എന്ന അളവിൽ പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ നേർപ്പിക്കുകയും 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡികൾ 1:5000 എന്ന അനുപാതത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ഊഷ്മാവിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.കെമിഡോക് എംപി ഇമേജിംഗ് സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് കെമിലുമിനെസെൻസ് ഉപയോഗിച്ചാണ് ചർമ്മം ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചത്.ചിത്രത്തിലെ ബ്ലോട്ടുകളുടെയും ജെല്ലുകളുടെയും കട്ട് ചെയ്യാത്ത എല്ലാ സ്കാനുകളും റോ ഡാറ്റയായി അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.
ഈ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ച പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികളിൽ റാബിറ്റ് ആന്റി-എസ്എഫ്പിക്യു മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (സിഎസ്ടി, നമ്പർ 71992), റാബിറ്റ് ആന്റി-എഫ്യുഎസ് മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (സിഎസ്ടി, നമ്പർ. 67840), റാബിറ്റ് ആന്റി-എൻഎസ്യുഎൻ2 പോളിക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (പ്രോട്ടീൻടെക്, നമ്പർ 20854-1-1-1- AP), റാബിറ്റ് ആന്റി-mSin3A പോളിക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (Abcam, #ab3479), മൗസ് ആന്റി-ടാഗ് മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (TransGen, #HT201-02), മൗസ് ആന്റി-β-ആക്റ്റിൻ മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (TransGen, #HC201-01), റാബിറ്റ് ആന്റി -CDK2 മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (ABclonal, #A0094), റാബിറ്റ് മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി ടു CTBP1 (ABclonal, #A11600), റാബിറ്റ് പോളിക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി ടു DUT (ABclonal, #A2901), റാബിറ്റ് പോളിക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി PSMC4 (ABclonal, #Arabbit) DNAJB1 പോളിക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (ABclonal, # A5504).ഈ ആന്റിബോഡികൾ ടിബിഎസ്ടിയിൽ 1:1000 നേർപ്പിച്ച 5% സ്കിം പാലിൽ ഉപയോഗിച്ചു.ഈ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡികളിൽ ആന്റി-റാബിറ്റ് IgG (TransGen, #HS101-01), ആന്റി-മൗസ് IgG (TransGen, #HS201-01) 1:5000 നേർപ്പിക്കൽ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.
BRD4 SFPQ-മായി ഇടപഴകുന്നുണ്ടോ എന്ന് കൂടുതൽ അന്വേഷിക്കാൻ, HEK293T അമിതമായി പ്രകടമാക്കുന്ന സ്ഥിരതയുള്ള HEK293T, BRD4-miniSOG സെല്ലുകൾ 10 സെന്റീമീറ്റർ പാത്രങ്ങളിൽ പൂശിയിരിക്കുന്നു.കോശങ്ങൾ തണുത്ത പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി 1 മില്ലി പിയേഴ്സ് ഐപി ലിസിസ് ബഫറിൽ (തെർമോ ഫിഷർ, #87787) EDTA-രഹിത പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് 30 മിനിറ്റ് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ലൈസ് ചെയ്തു.അതിനുശേഷം, ലൈസെറ്റുകൾ 1.5 മില്ലി സെന്റീഫ്യൂജ് ട്യൂബുകളിൽ ശേഖരിക്കുകയും 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 15,871 xg സെന്റീഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.സൂപ്പർനാറ്റന്റ് വിളവെടുക്കുകയും 5 µg ആന്റി-വി5 ലേബൽ ചെയ്ത മൗസ് മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (CST, #80076) ഉപയോഗിച്ച് ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.ഏകദേശം 50 µl പ്രോട്ടീൻ A/G മാഗ്നറ്റിക് ബീഡുകൾ (MCE, #HY-K0202) 0.5% Tween-20 അടങ്ങിയ PBS ഉപയോഗിച്ച് രണ്ടുതവണ കഴുകുക.തുടർന്ന് സെൽ ലൈസറ്റുകൾ 4 മണിക്കൂർ നേരം കാന്തിക മുത്തുകൾ ഉപയോഗിച്ച് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ താഴെ നിന്ന് മുകളിലേക്ക് ഭ്രമണം ചെയ്തു.അതിനുശേഷം മുത്തുകൾ 1 മില്ലി പിബിഎസ്ടി ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് നാല് തവണ കഴുകി 95 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 5 മിനിറ്റ് തിളപ്പിക്കുക.SDS-PAGE ജെല്ലുകളിൽ സാമ്പിളുകൾ വിശകലനം ചെയ്യുകയും സാധാരണ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് PVDF മെംബ്രണുകളിലേക്ക് മാറ്റുകയും ചെയ്തു.ടിബിഎസ്ടിയിലെ 5% സ്കിം മിൽക്കിൽ സ്തരങ്ങൾ തടയുകയും പ്രാഥമിക, ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് തുടർച്ചയായി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.പ്രൈമറി ആന്റിബോഡി റാബിറ്റ് ആന്റി-എസ്‌എഫ്‌പിക്യു മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി (സിഎസ്‌ടി, #71992) ടിബിഎസ്‌ടിയിൽ 5% സ്‌കിം മിൽക്കിൽ 1:1000 എന്ന അനുപാതത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.ആന്റി-റാബിറ്റ് IgG 1:5000 എന്ന അനുപാതത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുകയും ഊഷ്മാവിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.കെമിഡോക് എംപി ഇമേജിംഗ് സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് കെമിലുമിനെസെൻസ് ഉപയോഗിച്ചാണ് ചർമ്മം ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചത്.
സോൾവെന്റ് ആക്‌സസിബിൾ സർഫേസ് ഏരിയ (SASA) വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന എല്ലാ ഘടനകളും പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റാ ബാങ്ക് (PDB)52 അല്ലെങ്കിൽ ആൽഫഫോൾഡ് പ്രോട്ടീൻ സ്ട്രക്ചർ ഡാറ്റാബേസ്53 എന്നിവയിൽ നിന്നാണ് ലഭിച്ചത്.FreeSASA പ്രോഗ്രാം ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ അവശിഷ്ടത്തിനും സമ്പൂർണ്ണ SASA കണക്കാക്കുന്നു.ഓരോ ഘടനയ്ക്കും ശരാശരി SASA ലഭിക്കുന്നതിന്, ലേബൽ ചെയ്ത ഹിസ്റ്റിഡിനും അതിന്റെ അയൽക്കാർക്കുമുള്ള പൂർണ്ണവും വ്യക്തമല്ലാത്തതുമായ SASA ഡാറ്റ മാത്രമേ ഉപയോഗിച്ചിട്ടുള്ളൂ.ഓരോ ഹിസ്റ്റിഡൈനിനുമുള്ള ആപേക്ഷിക ലായക പ്രവേശനക്ഷമത (ആർഎസ്എ) കണക്കാക്കുന്നത് ലായകത്തിന് ലഭ്യമായ അനുഭവപരമായ പരമാവധി ശേഷിക്കുന്ന ഉപരിതല വിസ്തീർണ്ണം കൊണ്ട് കേവല SASA മൂല്യത്തെ ഹരിച്ചാണ്.ശരാശരി RSA 20% ത്തിൽ താഴെയാണെങ്കിൽ എല്ലാ ഹിസ്‌റ്റിഡിനുകളും മറഞ്ഞിരിക്കുന്നതായി തരംതിരിച്ചു.
ഡിഡിഎ മോഡിൽ ലഭിച്ച അസംസ്‌കൃത ഫയലുകൾ, സാധാരണ മലിനീകരണം അടങ്ങിയ ഉചിതമായ SwissProt പരിശോധിച്ച പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റാബേസിൽ Proteome Discoverer (v2.5) അല്ലെങ്കിൽ MSfragger (Fragpipe v15.0) ഉപയോഗിച്ച് തിരഞ്ഞു.പെപ്റ്റൈഡുകൾക്ക് രണ്ട് ക്ലിവേജ് സൈറ്റുകൾ ഇല്ലാത്ത പൂർണ്ണമായ ട്രൈപ്സിൻ ആവശ്യമാണ്, കാർബമോയിൽ മെഥൈലേഷൻ ഒരു നിശ്ചിത പരിഷ്ക്കരണമായും മെഥിയോണിൻ ഓക്സിഡേഷനും ഡൈനാമിക് മോഡിഫിക്കേഷനായി.മുൻഗാമിയും ഫ്രാഗ്മെന്റ് ഭാരവും യഥാക്രമം 10 ppm, 0.02 Da (MS2 Orbitrap) ആയി സജ്ജീകരിച്ചു. മലിനീകരണ ഹിറ്റുകൾ നീക്കം ചെയ്തു, <1% എന്ന തെറ്റായ കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് ലഭിക്കുന്നതിന് പ്രോട്ടീനുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്തു. മലിനീകരണ ഹിറ്റുകൾ നീക്കം ചെയ്തു, <1% എന്ന തെറ്റായ കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് ലഭിക്കുന്നതിന് പ്രോട്ടീനുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്തു. പോപാഡനിയ സാഗ്രിയസ്‌നയുഷ്‌ക് വെസ്‌റ്റ്‌വ് ബൈലി ഉദലെന്ы, എ ബെൽക്കി ഒട്ടിലിട്രോവാൻ, ച്തൊബ്ы പൊലുഛ്യ്ത് കോഫിന്ഗ്സ് തെറ്റായ കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് <1% നൽകുന്നതിനായി മലിനീകരണ ഹിറ്റുകൾ നീക്കം ചെയ്യുകയും പ്രോട്ടീനുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 പൊപദംയ്യ സാഗ്രിയസ്നയുസ്ഛ്യ്ഹ് വെസ്ഛെസ്ത്വ് ബ്ыലി ഉദലെന്ы, ഒരു ബെൽകി ഒത്ഫിലിത്രൊവന്ы വരെ <% <1% എന്ന തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് നിരക്ക് കൈവരിക്കാൻ മലിനീകരണ ഹിറ്റുകൾ നീക്കം ചെയ്യുകയും പ്രോട്ടീനുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.ലേബലുകൾ ഉപയോഗിക്കാതെ അളവ് വിശകലനത്തിനായി, മൂന്ന് ജൈവിക ആവർത്തനങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള നോർമലൈസ്ഡ് പ്രോട്ടീൻ ഉള്ളടക്കം ഉപയോഗിച്ചു.ഡേവിഡ് ബയോഇൻഫോർമാറ്റിക്‌സ് റിസോഴ്‌സസ്, മിറ്റോകാർട്ട 3.0, ആലിസ് ടിംഗ് ഗ്രൂപ്പ് സമാഹരിച്ച് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച ഡാറ്റാബേസുകളിൽ നിന്നുള്ള ജീൻ ഒന്റോളജി (GO) വിശകലനം ഉപയോഗിച്ചാണ് പ്രോട്ടീൻ സബ്‌സെല്ലുലാർ ലോക്കലൈസേഷൻ വിശകലനം നടത്തിയത്.അഗ്നിപർവ്വത ഭൂപടം പെർസിയസിൽ നിന്നാണ് ലഭിച്ചത് (v1.6.15.0). രണ്ട് വശങ്ങളുള്ള ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ പ്രാധാന്യത്തിനായി പ്രോട്ടീൻ സമൃദ്ധിയുടെ മടക്കുകൾ പരിശോധിച്ചു, കൂടാതെ പ്രോട്ടീൻ ഹിറ്റുകൾ സമൃദ്ധമായ മാറ്റം > 2 (മറ്റൊരു തരത്തിൽ പറഞ്ഞിട്ടില്ലെങ്കിൽ) p മൂല്യം <0.05 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് തിരിച്ചറിഞ്ഞു. രണ്ട് വശങ്ങളുള്ള ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ പ്രാധാന്യത്തിനായി പ്രോട്ടീൻ സമൃദ്ധിയുടെ മടക്കുകൾ പരിശോധിച്ചു, കൂടാതെ പ്രോട്ടീൻ ഹിറ്റുകൾ സമൃദ്ധമായ മാറ്റം > 2 (മറ്റൊരു തരത്തിൽ പറഞ്ഞിട്ടില്ലെങ്കിൽ) p മൂല്യം <0.05 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് തിരിച്ചറിഞ്ഞു. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. രണ്ട് വാലുള്ള ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ പ്രാധാന്യത്തിനായി പ്രോട്ടീൻ ഉള്ളടക്ക ഫോൾഡ് മാറ്റങ്ങൾ പരീക്ഷിച്ചു, കൂടാതെ പ്രോട്ടീൻ പൊരുത്തങ്ങൾ ഉള്ളടക്ക മാറ്റം > 2 (അല്ലാതെ ശ്രദ്ധിക്കാത്തത്) കൂടാതെ ap മൂല്യം <0.05 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് തിരിച്ചറിഞ്ഞു.使用 双边 t 检验 测试 测试 蛋白质 变化 变化 的 统计 显着性, 并 确定 蛋白质 中 中 的 丰度 变化> 2 (除非 另另 有) 和 p 值 <0.05.使用 双边 双边 检验 测试 蛋白质 变化 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 中 中 的 丰度 变化> 2 (另 有有) 和 p 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. രണ്ട്-വാലുള്ള ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ ഉള്ളടക്കത്തിലെ മടങ്ങ് മാറ്റങ്ങളുടെ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് പ്രാധാന്യം പരിശോധിച്ചു, കൂടാതെ ഉള്ളടക്ക മാറ്റങ്ങൾ> 2 (അല്ലെങ്കിൽ സൂചിപ്പിച്ചിട്ടില്ലെങ്കിൽ) p- മൂല്യങ്ങൾ <0.05 എന്നിവയ്ക്കായി പ്രോട്ടീൻ പൊരുത്തങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു.സ്ട്രിംഗ് ഡാറ്റാബേസിനൊപ്പം GO വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ ഇന്ററാക്ഷൻ വിശകലനം നടത്തി.
സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ മൂന്ന് ജൈവ പകർപ്പുകൾ നടത്തി.ഗ്രാഫ്‌പാഡ് പ്രിസം (ഗ്രാഫ്‌പാഡ് സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ) ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനം നടത്തി, പെർസിയസ് ഉപയോഗിച്ച് അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ടുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു (v1.6.15.0).രണ്ട് ഗ്രൂപ്പുകളെ താരതമ്യം ചെയ്യാൻ, രണ്ട് വാലുള്ള വിദ്യാർത്ഥികളുടെ ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് p- മൂല്യങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു.പരീക്ഷണ ഗ്രൂപ്പിൽ രണ്ടുതവണയെങ്കിലും തിരിച്ചറിഞ്ഞ സിംഗിൾടൺ പ്രോട്ടീനുകൾ മാത്രമേ അഗ്നിപർവ്വത പ്ലോട്ടുകളിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുള്ളൂ, കൂടാതെ നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പിലെ നഷ്ടപ്പെട്ട മൂല്യങ്ങൾ പെർസിയസ് ഉപയോഗിച്ച് സാധാരണ വിതരണത്തിൽ നിന്ന് മാറ്റി, അങ്ങനെ p- മൂല്യം കണക്കാക്കാൻ കഴിയും.പിശക് ബാറുകൾ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനത്തിനായുള്ള പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനങ്ങളിൽ, കുറഞ്ഞത് രണ്ട് ബയോളജിക്കൽ റെപ്ലിക്കേറ്റുകളിലെങ്കിലും പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളുടെ സമൃദ്ധി നിലനിർത്തി.സാമ്പിൾ വലുപ്പം മുൻകൂട്ടി നിശ്ചയിക്കാൻ സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ രീതികൾ ഉപയോഗിച്ചിട്ടില്ല.പരീക്ഷണങ്ങൾ ക്രമരഹിതമല്ല.ഫലങ്ങളുടെ പരീക്ഷണത്തിലും വിലയിരുത്തലിലും ഗവേഷകർ ടാസ്‌ക്കുകളിൽ അന്ധനായിരുന്നില്ല.
പഠന രൂപകല്പനയെക്കുറിച്ചുള്ള കൂടുതൽ വിവരങ്ങൾക്ക്, ഈ ലേഖനവുമായി ലിങ്ക് ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന നേച്ചർ റിസർച്ച് റിപ്പോർട്ട് സംഗ്രഹം കാണുക.
ഈ പഠനത്തിൽ ലഭിച്ച മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി ഡാറ്റ, ഡാറ്റാസെറ്റ് ഐഡി PXD034811 (PDPL-MS ഡാറ്റാസെറ്റ്)-ന് കീഴിലുള്ള iProX57 പങ്കാളി ശേഖരം വഴി ProteomeXchange കൺസോർഷ്യത്തിന് സമർപ്പിച്ചു.റോ ഡാറ്റ ഫയലുകളുടെ രൂപത്തിലാണ് റോ ഡാറ്റ നൽകിയിരിക്കുന്നത്.ഈ ലേഖനം യഥാർത്ഥ ഡാറ്റ നൽകുന്നു.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. അയൽപക്കത്തെ പരിചയപ്പെടൽ: പ്രോക്‌സിമിറ്റി-ആശ്രിത ബയോട്ടിനൈലേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളും മാപ്പ് അവയവങ്ങളും. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. അയൽപക്കത്തെ പരിചയപ്പെടൽ: പ്രോക്‌സിമിറ്റി-ആശ്രിത ബയോട്ടിനൈലേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളും മാപ്പ് അവയവങ്ങളും.Gingras, AS, Abe, KT, Raut, B. ചുറ്റുപാടുകളുമായുള്ള പരിചയം: പ്രോക്‌സിമിറ്റി ആശ്രിത ബയോട്ടിനൈലേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളും മാപ്പ് ഓർഗനല്ലുകളും. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合瘛并质复合瘛平幸 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. അയൽപക്കത്തെ മനസ്സിലാക്കൽ: ജൈവജീവിതത്തിൽ അയൽപക്കത്തിന്റെ ആശ്രിതത്വം ഉപയോഗിക്കുക.Gingras, AS, Abe, KT, Raut, B. പ്രോക്‌സിമിറ്റി മനസ്സിലാക്കൽ: പ്രോക്‌സിമിറ്റി ആശ്രിത ബയോട്ടിനൈലേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളുടെ സ്വഭാവവും അവയവങ്ങളുടെ മാപ്പിംഗും.നിലവിലുള്ളത്.എന്റെ അഭിപ്രായം.രാസവസ്തു.ജീവശാസ്ത്രം 48, 44–54 (2019).
ജെറി, ജെബി തുടങ്ങിയവർ.രോഗപ്രതിരോധ കോശങ്ങളിലേക്ക് ഡെക്സ്റ്റർ ഊർജ്ജം കൈമാറുന്നതിലൂടെ സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതിയുടെ മാപ്പിംഗ്.സയൻസ് 367, 1091–1097 (2020).
ഹെർട്ട്ലിംഗ്, EL et al.രണ്ട്-പ്രോട്ടീം സ്കെയിൽ നെറ്റ്‌വർക്കുകൾ മനുഷ്യ ഇന്ററാറ്റോമിന്റെ സെൽ-നിർദ്ദിഷ്ട പുനർനിർമ്മാണം കണ്ടെത്തുന്നു.സെല്ലുകൾ 184, 3022–3040.e3028 (2021).