വാർത്ത

Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുണ്ട്.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).അതിനിടയിൽ, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് റെൻഡർ ചെയ്യും.
കാൻസർ കോശങ്ങൾ സെല്ലുലാർ സമ്മർദ്ദത്തെ അതിജീവിക്കാനും പുരോഗതി തുടരാനും വിവിധ സംവിധാനങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്.പ്രോട്ടീൻ കൈനാസ് R (PKR), അതിന്റെ പ്രോട്ടീൻ ആക്റ്റിവേറ്റർ (PACT) എന്നിവ കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെയും അപ്പോപ്റ്റോസിസിനെയും തടയുന്നതിലേക്ക് നയിക്കുന്ന വിവിധ സമ്മർദ്ദ സിഗ്നലുകൾ നിരീക്ഷിക്കുന്ന പ്രാരംഭ പ്രതികരണങ്ങളാണ്.എന്നിരുന്നാലും, കാൻസർ കോശങ്ങളിലെ PACT-PKR പാതയുടെ നിയന്ത്രണം വലിയ തോതിൽ അജ്ഞാതമായി തുടരുന്നു.ഇവിടെ, നീണ്ട നോൺ-കോഡിംഗ് ആർഎൻഎ (എൽഎൻസിആർഎൻഎ) അസ്പാർട്ടൈൽ ടിആർഎൻഎ സിന്തറ്റേസ് ആന്റിസെൻസ് ആർഎൻഎ 1 (ഡിഎആർഎസ്-എഎസ്1) PACT-PKR പാതയെ തടയുന്നതിൽ നേരിട്ട് ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്നും കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതായും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.CRISPRi 971 ക്യാൻസറുമായി ബന്ധപ്പെട്ട lncRNA യുടെ വലിയ തോതിലുള്ള ഫങ്ഷണൽ സ്ക്രീനിംഗ് ഉപയോഗിച്ച്, DARS-AS1 ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്തിയ കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.അതിനാൽ, DARS-AS1 നോക്കൗട്ട് കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെ തടയുകയും വിട്രോയിലെ വിവിധ കാൻസർ സെൽ ലൈനുകളിൽ കാൻസർ സെൽ അപ്പോപ്റ്റോസിസിനെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുകയും വിവോയിലെ ട്യൂമർ വളർച്ചയെ ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.യാന്ത്രികമായി, DARS-AS1 നേരിട്ട് PACT ആക്ടിവേഷൻ ഡൊമെയ്‌നുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും PACT-PKR ഇടപെടൽ തടയുകയും അതുവഴി PKR ആക്റ്റിവേഷൻ, eIF2α ഫോസ്‌ഫോറിലേഷൻ എന്നിവ കുറയ്ക്കുകയും അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് കോശ മരണത്തെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു.ക്ലിനിക്കലായി, ഒന്നിലധികം ക്യാൻസറുകളിൽ DARS-AS1 വ്യാപകമായി പ്രകടമാണ്, കൂടാതെ ഈ lncRNA യുടെ അമിതമായ എക്സ്പ്രഷൻ മോശം രോഗനിർണയത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഈ പഠനം DARS-AS1 lncRNA മുഖേന PACT-PKR പാതയുടെ കാൻസർ-നിർദ്ദിഷ്ട നിയന്ത്രണം വ്യക്തമാക്കുകയും കാൻസർ രോഗനിർണയത്തിനും ചികിത്സയ്ക്കുമായി മറ്റൊരു ലക്ഷ്യം നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു.
സമ്മർദ്ദത്തോട് പൊരുത്തപ്പെടാനുള്ള കഴിവ് കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ അതിജീവനത്തിന്റെയും വ്യാപനത്തിന്റെയും ഒരു പ്രധാന സ്വഭാവമാണ്.കാൻസറിന്റെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള വ്യാപനവും ഉപാപചയ സവിശേഷതകളും കഠിനമായ സൂക്ഷ്മ പരിതസ്ഥിതികളിൽ ഉയർന്നുവരുന്നു-പോഷകാഹാരക്കുറവ്, ഹൈപ്പോക്സിയ, കുറഞ്ഞ pH- ഇത് കോശങ്ങളുടെ മരണ സിഗ്നലിംഗ് പാതകളെ ട്രിഗർ ചെയ്യും.പി535, ഹീറ്റ് ഷോക്ക് പ്രോട്ടീനുകൾ 6, 7, KRAS8, 9, എച്ച്ഐഎഫ്-110, 11, 12, 13 തുടങ്ങിയ സ്ട്രെസ് സെൻസിറ്റീവ് ജീനുകളുടെ ക്രമരഹിതമായ നിയന്ത്രണം ക്യാൻസറിൽ പതിവായി നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു, അതുവഴി അപ്പോപ്റ്റോസിസിനെ തടയുകയും അതിജീവനം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.
പ്രോട്ടീൻ കൈനസ് R (PKR) ഒരു പ്രധാന സ്ട്രെസ് സെൻസറും യൂക്കറിയോട്ടിക് ഇനീഷ്യേഷൻ ഫാക്ടർ 2α (eIF2α) യുടെ ഉപയൂണിറ്റ് കൈനസും ആണ്, ഇത് സെല്ലുലാർ സ്ട്രെസിനെ കോശ മരണവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന ഒരു വിവർത്തന നിയന്ത്രണമാണ്.ഒരു വിദേശ ഡബിൾ സ്‌ട്രാൻഡഡ് ആർ‌എൻ‌എ (ഡി‌എസ്‌ആർ‌എൻ‌എ) കണ്ടെത്തുന്നതിലൂടെയാണ് പി‌കെ‌ആർ യഥാർത്ഥത്തിൽ ആന്റിവൈറൽ പ്രോട്ടീനായി തിരിച്ചറിഞ്ഞത്.സജീവമാക്കുമ്പോൾ, വൈറൽ, സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടീൻ സമന്വയത്തെ തടയാൻ PKR eIF2α ഫോസ്ഫോറിലേറ്റുകൾ 14,15,16.dsRNA17,18,19,20,21,22,23 ന്റെ അഭാവത്തിൽ ആദ്യത്തെ PKR ആക്റ്റിവേറ്റർ പ്രോട്ടീനായി PACT (PKR ആക്റ്റിവേറ്റർ പ്രോട്ടീൻ) തിരിച്ചറിഞ്ഞു.പി‌കെ‌ആറുമായുള്ള നേരിട്ടുള്ള ഇടപെടലിലൂടെ, പി‌എ‌സി‌ടി വിവിധ സമ്മർദ്ദങ്ങളെ (സെറം പട്ടിണി, പെറോക്‌സൈഡ് അല്ലെങ്കിൽ ആർസെനൈറ്റ് ചികിത്സ) പി‌കെ‌ആറിലേക്കും ഡൗൺസ്‌ട്രീം സിഗ്നലിംഗ് പാതകളിലേക്കും മാറ്റുന്നു.eIF2α ഫോസ്‌ഫോറിലേഷനു പുറമേ, പിഎസിടി-മെഡിയേറ്റഡ് പികെആർ ആക്റ്റിവേഷൻ സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട വിവിധ സംഭവങ്ങളെ ട്രിഗർ ചെയ്യുന്നു, PI3K/Akt24 പാത്ത്‌വേ വഴിയുള്ള മാറ്റം വരുത്തിയ റെഡോക്സ് സ്റ്റാറ്റസ്, p5325,26, NF-κB27,28 എന്നിവയിലൂടെയുള്ള മെച്ചപ്പെടുത്തിയ DNA കേടുപാടുകൾ പരിശോധിക്കുന്നു, 29 ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്നു. സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണം, വ്യാപനം, അപ്പോപ്റ്റോസിസ്, മറ്റ് പ്രധാന സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകൾ എന്നിവയിൽ അവരുടെ നിർണായക പങ്ക് കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, PKR ഉം PACT ഉം പല രോഗങ്ങൾക്കും, പ്രത്യേകിച്ച് ക്യാൻസർ30,31,32,33 എന്നിവയ്ക്കുള്ള ചികിത്സാ ലക്ഷ്യങ്ങൾ വാഗ്ദാനം ചെയ്യുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, ഈ പ്ലിയോട്രോപിക് പ്രവർത്തനപരവും ജൈവശാസ്ത്രപരവുമായ പ്രാധാന്യം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, കാൻസർ കോശങ്ങളിലെ PACT/PKR പ്രവർത്തനത്തിന്റെ നിയന്ത്രണം അവ്യക്തമായി തുടരുന്നു.
പ്രോട്ടീൻ-കോഡിംഗ് സാധ്യതകളില്ലാത്ത 200 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളേക്കാൾ വലിയ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളാണ് lncRNAകൾ.അത്യാധുനിക ജീനോം സീക്വൻസിങ് പ്രോജക്ടുകൾ ആയിരക്കണക്കിന് എൽഎൻസിആർഎൻഎകൾ കണ്ടെത്തിയതിനാൽ, അവയുടെ ജൈവിക പ്രവർത്തനങ്ങൾ വ്യക്തമാക്കുന്നതിന് 35,36 വളരെയധികം പരിശ്രമം നടത്തിയിട്ടുണ്ട്.എക്‌സ്-ക്രോമസോം നിഷ്‌ക്രിയമാക്കൽ38,39, ഇംപ്രിന്റിംഗ്40, ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ41,42, വിവർത്തനം43, കൂടാതെ ക്യാൻസർ വളർച്ച 44,45,46,47 എന്നിവയുടെ നിയന്ത്രണം ഉൾപ്പെടെ നിരവധി ജൈവ പ്രക്രിയകളിൽ lncRNA-കൾ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് വളർന്നുവരുന്ന ഒരു ഗവേഷണ സംഘം തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്.നിരവധി lncRNA-കൾ PACT/PKR പാതയിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് ഈ പഠനങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു.അത്തരത്തിലുള്ള ഒരു പഠനം, lncRNA ASPACT PACT ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷനെ തടയുകയും PACT mRNA യുടെ ന്യൂക്ലിയർ നിലനിർത്തൽ വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.മറ്റ് പഠനങ്ങൾ lncRNA nc886 PKR-മായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും അതിന്റെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ 49,50 തടയുകയും ചെയ്യുന്നു.ഇതുവരെ, PACT-മെഡിയേറ്റഡ് PKR ആക്ടിവേഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്ന lncRNA റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടില്ല.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ഒരു ഓങ്കോജെനിക് lncRNA51,52,53,54 ആയി തിരിച്ചറിഞ്ഞു.miP-194-5p53, miP-12952, miP-532-3p51 എന്നിവയുടെ നിയന്ത്രണത്തിലൂടെ, DARS-AS1 യഥാക്രമം വ്യക്തമായ കോശ വൃക്കസംബന്ധമായ സെൽ കാർസിനോമ, തൈറോയ്ഡ് കാർസിനോമ, നോൺ-സ്മോൾ സെൽ ലംഗ് കാർസിനോമ എന്നിവയുടെ വളർച്ചയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.പ്രോട്ടീൻ 39 (RBM39) RNA-ബൈൻഡിംഗ് മോട്ടിഫിന്റെ സ്ഥിരത നിലനിർത്തുന്നതിലൂടെ DARS-AS1 മൈലോമ പുരോഗതിയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ടോങ്ങും സഹപ്രവർത്തകരും കണ്ടെത്തി.എന്നിരുന്നാലും, ഈ lncRNA PACT-PKR ആക്റ്റിവേഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലും ക്യാൻസർ കോശങ്ങളുടെ സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണത്തിലും ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടോ എന്നതിനെക്കുറിച്ച് ഒരു പഠനവും നടന്നിട്ടില്ല.
ഇവിടെ, CRISPRi സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ ഒരു വലിയ തോതിലുള്ള ലോസ്-ഓഫ്-ഫംഗ്ഷൻ സ്‌ക്രീൻ നടത്തുകയും DARS-AS1 lncRNA നിരവധി തരം കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് നിർണ്ണയിക്കുകയും ചെയ്തു.കൂടാതെ, ഞങ്ങൾ ഒരു പ്രധാന സംവിധാനം തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്: DARS-AS1 നേരിട്ട് PACT-ലേക്ക് ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, PACT, PKR ബൈൻഡിംഗിനെ തടയുന്നു, താഴ്ന്ന PKR അടിവസ്ത്രമായ eIF2α യുടെ ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ തടയുന്നു, ആത്യന്തികമായി അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് കോശ മരണത്തെ തടയുന്നു.ഉപസംഹാരമായി, PACT-PKR പാതയുടെ റെഗുലേറ്റർ എന്ന നിലയിലും കാൻസർ ചികിത്സയ്ക്കും രോഗനിർണയത്തിനുമുള്ള സാധ്യതയുള്ള ലക്ഷ്യമായും ഞങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനം DARS-AS1 lncRNA വെളിപ്പെടുത്തുന്നു.
വിപുലമായ ജീനോമിക് പ്രൊഫൈലിംഗ് പഠനങ്ങൾ ക്യാൻസറുമായി ബന്ധപ്പെട്ട നൂറുകണക്കിന് lncRNA-കൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്.എന്നിരുന്നാലും, അവയുടെ പ്രവർത്തനം മിക്കവാറും അജ്ഞാതമായി തുടരുന്നു.കാൻസർ പുരോഗതിയിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന വാഗ്ദാനമുള്ള lncRNA കാൻഡിഡേറ്റുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ, CRISPRi സിസ്റ്റം (ചിത്രം 1a) ഉപയോഗിച്ച് SW620 കൊളോറെക്റ്റൽ കാൻസർ സെൽ ലൈനിലെ വ്യാപനം കുറയ്ക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ ഒരു ലോസ്-ഓഫ്-ഫംഗ്ഷൻ സ്‌ക്രീൻ നടത്തി.SW480, SW620 വൻകുടൽ കാൻസർ സെൽ ലൈനുകളുടെ പ്രത്യേകത, അവ ഒരു രോഗിയുടെ പ്രാഥമിക, ദ്വിതീയ മുഴകളിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞതാണ് എന്നതാണ്.വിപുലമായ വൻകുടൽ കാൻസറിന്റെ പുരോഗതിയിലെ ജനിതക മാറ്റങ്ങൾ പഠിക്കുന്നതിന് ഇത് വിലപ്പെട്ട ഒരു താരതമ്യം നൽകുന്നു.അതിനാൽ, ഞങ്ങൾ RNA സീക്വൻസിങ് ഉപയോഗിച്ച് വൻകുടൽ കാൻസർ സെൽ ലൈനുകളുടെ (SW480, SW620) ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമുകൾ വിശകലനം ചെയ്യുകയും പ്രസിദ്ധീകരിച്ച സാഹിത്യത്തിൽ നിന്ന് ചില പ്രവർത്തനക്ഷമമായ lncRNA-കൾ ശേഖരിക്കുകയും ചെയ്തു.ഈ ഫലങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, 971 ക്യാൻസറുമായി ബന്ധപ്പെട്ട എൽഎൻസിആർഎൻഎകളും ലക്ഷ്യമാക്കാത്ത 500 എസ്ജിആർഎൻഎ ഒളിഗോകളും ലക്ഷ്യമാക്കി 7355 എസ്ജിആർഎൻഎ ഒലിഗോകൾ അടങ്ങിയ ഒരു പൂൾ ചെയ്ത എസ്ജിആർഎൻഎ ലൈബ്രറി ഞങ്ങൾ രൂപകൽപന ചെയ്തു (സപ്ലിമെന്ററി ഡാറ്റ 1).
CRISPRi സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ചുള്ള സ്ക്രീനിംഗിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് പ്രാതിനിധ്യം.b sgRNA സമ്പുഷ്ടീകരണം സ്ക്രീനിംഗിന് ശേഷം.തിരശ്ചീനമായ ഡോട്ടഡ് ലൈൻ log2 (മടക്ക മാറ്റം) = ± 0.58 പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.ലംബ ഡോട്ട് ലൈൻ p മൂല്യം = 0.05 സൂചിപ്പിക്കുന്നു.കറുത്ത ഡോട്ടുകൾ നോൺ-ടാർഗെറ്റ് sgRNA (NC എന്ന് നിയുക്തമാക്കിയത്) പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.DARS-AS1 ലക്ഷ്യമിടുന്ന sgRNAകളാണ് ചുവന്ന ഡോട്ടുകൾ.മുമ്പ് വിവരിച്ച ഓങ്കോജെനിക് lncRNA ആയ LINC00205 ടാർഗെറ്റുചെയ്യുന്ന sgRNAകളാണ് ബ്ലൂ ഡോട്ടുകൾ.മടക്ക മാറ്റം = (സാധാരണ വായന, ദിവസം 17)/(സാധാരണ വായന, ദിവസം 0).c DARS-AS1 sgRNA നോക്ക്ഡൗൺ കോശ വളർച്ചയെ തടഞ്ഞു.പിശക് ബാറുകൾ മൂന്ന് പരീക്ഷണങ്ങളുടെ ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.* പി ≤ 0.05, ** പി ≤ 0.01 ടു ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി-ടെസ്റ്റ്.ട്യൂമറുകളിലെ d DARS-AS1 എക്സ്പ്രഷൻ (TCGA ഡാറ്റാസെറ്റ്).യഥാക്രമം BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, COAD എന്നിവയുള്ള രോഗികളിൽ നിന്നുള്ള ജോടിയാക്കിയ നോർമൽ, ട്യൂമർ സാമ്പിളുകളിൽ DARS-AS1 ന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ (TCGA ഡാറ്റാസെറ്റ്).ജോടിയാക്കിയ ടു-ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് p-മൂല്യങ്ങൾ ലഭിച്ചത്.
പ്ലാസ്മിഡ് നിർമ്മിച്ച് ലെന്റിവൈറസ് പാക്കേജ് ചെയ്ത ശേഷം, നാല് സ്വതന്ത്ര അണുബാധ പരീക്ഷണങ്ങളിലൂടെ ഞങ്ങൾ മുകളിലുള്ള ലൈബ്രറിയുമായി dCas9-SW620 വൻകുടൽ കാൻസർ സെൽ ലൈൻ ട്രാൻസ്ഡ്യൂസ് ചെയ്തു.ഈ അണുബാധകൾക്കുള്ള അണുബാധയുടെ മൾട്ടിപ്ലസിറ്റി (MOI) 0.1-0.3 ആയിരുന്നു, ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ഓരോ സെല്ലും ഒരു sgRNA ഉപയോഗിച്ച് മാത്രമേ കൈമാറ്റം ചെയ്യാൻ കഴിയൂ എന്നാണ്.18 ദിവസത്തെ ഇൻ വിട്രോ കൾച്ചറിന് ശേഷം, സ്ക്രീനിംഗിന് ശേഷം ടാർഗെറ്റ് sgRNA-കളുടെ സമ്പുഷ്ടീകരണ പ്രൊഫൈൽ കുറയുകയോ വർദ്ധിക്കുകയോ ചെയ്തു, അതേസമയം നോൺ-ടാർഗെറ്റഡ് കൺട്രോൾ ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുടെ എണ്ണം പ്രീ-സ്‌ക്രീനിംഗ് പ്രൊഫൈലുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ താരതമ്യേന മാറ്റമില്ലാതെ തുടരുന്നു, ഇത് ഞങ്ങളുടെ ലക്ഷ്യത്തിന് ഉയർന്ന സ്‌ക്രീൻ-നിർദ്ദിഷ്ടത ഉണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. പുസ്തകശാല.അരി.1b, സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 1). LINC00205, ശ്വാസകോശ അർബുദവും കരൾ കാൻസർ പുരോഗതിയും 58,59,60 പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിരുന്നു (ലോഗ് 2 (ഫോൾഡ് ചേഞ്ച്) <-0.58, p മൂല്യം <0.05), ഈ സ്ക്രീനിംഗിന്റെ വിശ്വാസ്യത സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു (ചിത്രം 1 ബി). LINC00205, ശ്വാസകോശ അർബുദവും കരൾ കാൻസർ പുരോഗതിയും 58,59,60 പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിരുന്നു (ലോഗ് 2 (ഫോൾഡ് ചേഞ്ച്) <-0.58, p മൂല്യം <0.05), ഈ സ്ക്രീനിംഗിന്റെ വിശ്വാസ്യത സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു (ചിത്രം 1 ബി). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, ശ്വാസകോശ അർബുദത്തിന്റെയും കരൾ കാൻസറിന്റെയും പുരോഗതിയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ടുചെയ്‌തു. . Linc00205 之前 被 被 报道 促进 肺癌 和 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 选 选 掉 掉 掉 掉 掉 掉 掉 掉 掉变化 (倍数 倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 (图 图 图图). Linc00205 之前 被 被 报道 促进 肺癌 和 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 选 选 掉 掉 掉 掉 掉 掉 掉 掉 掉变化 (倍数 倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 (图 图 图图). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, ശ്വാസകോശത്തിലെയും കരളിലെയും അർബുദ പുരോഗതിയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ടുചെയ്ത 58,59,60, ഒഴിവാക്കപ്പെട്ടു (ലോഗ്2 (മടങ്ങ് മാറ്റം) <-0.58, p-മൂല്യം <0.05), ഈ സ്ക്രീനിംഗിന്റെ ദൃഢത സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു (ചിത്രം. 1 ബി).
പരീക്ഷിച്ച എല്ലാ lncRNA-കളിലും, DARS-AS1-ഉം സ്‌ക്രീൻ ചെയ്‌തു, 18 ദിവസത്തെ സംസ്‌കാരത്തിന് ശേഷം മൂന്ന് കോഗ്നേറ്റ് sgRNA ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു, ഈ lncRNA യുടെ തകരാർ ക്യാൻസർ വ്യാപനം കുറയുന്നതിന് കാരണമായി (ചിത്രം 1 ബി).കൺട്രോൾ സെല്ലുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ DARS-AS1 നോക്ക്ഡൗൺ സെല്ലുകളുടെ വളർച്ചാ നിരക്ക് പകുതിയായി കുറഞ്ഞുവെന്നും (ചിത്രം 1 സി) മറ്റ് നിരവധി ക്യാൻസർ തരങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള മുൻ റിപ്പോർട്ടുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നുവെന്നും കാണിക്കുന്ന കൊളോറെക്റ്റൽ കാൻസർ കോശങ്ങളിലെ MTS വിശകലനം ഈ ഫലത്തെ കൂടുതൽ പിന്തുണച്ചു.: ക്ലിയർ സെൽ കിഡ്നി കാൻസർ, തൈറോയ്ഡ് കാൻസർ, നോൺ-സ്മോൾ സെൽ ലംഗ് കാൻസർ51,52,53,55.എന്നിരുന്നാലും, വൻകുടൽ കാൻസറിലെ അതിന്റെ പ്രവർത്തനവും തന്മാത്രാ സംവിധാനങ്ങളും പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യപ്പെടാതെ തുടരുന്നു.അതിനാൽ, കൂടുതൽ പഠനത്തിനായി ഞങ്ങൾ ഈ lncRNA തിരഞ്ഞെടുത്തു.
രോഗികളിൽ DARS-AS1 എക്സ്പ്രഷൻ പഠിക്കാൻ, കാൻസർ ജീനോം അറ്റ്ലസ് (TCGA) പ്രോജക്റ്റിൽ നിന്ന് 10,327 ട്യൂമർ സാമ്പിളുകൾ ഞങ്ങൾ സമഗ്രമായി വിശകലനം ചെയ്തു.കോളൻ അഡിനോകാർസിനോമ (COAD), വൃക്കസംബന്ധമായ ക്ലിയർ സെൽ കാർസിനോമ (KIRC), വൃക്കസംബന്ധമായ പാപ്പില്ലറി സെൽ കാർസിനോമ (KIRP) എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള വിവിധ ട്യൂമറുകളിലെ ആരോഗ്യമുള്ള കോശങ്ങളിൽ DARS-AS1 വ്യാപകമായി പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുകയും ഗണ്യമായി നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുകയും ചെയ്തിട്ടുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു..വളരെ കുറച്ച് (ചിത്രം. 1d, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1a, b). ജോടിയാക്കിയ ആരോഗ്യമുള്ള/ട്യൂമർ സാമ്പിളുകളുടെ വിശകലനം, ബ്ലാഡർ യൂറോതെലിയൽ കാർസിനോമ (BLCA), കിഡ്‌നി റെനൽ ക്ലിയർ സെൽ കാർസിനോമ (KIRC), പ്രോസ്റ്റേറ്റ് അഡിനോകാർസിനോമ (PRAD), ശ്വാസകോശ സ്‌ക്വാമസ് സെൽ കാർസിനോമ (LUSC) എന്നിവയുടെ മുഴകളിൽ DARS-AS1 ന്റെ ഉയർന്ന പ്രകടനത്തെ കൂടുതൽ സ്ഥിരീകരിച്ചു. , ഗർഭാശയ കോർപ്പസ് എൻഡോമെട്രിയൽ കാർസിനോമ (UCEC), ശ്വാസകോശ അഡിനോകാർസിനോമ (LUAD), കരൾ ഹെപ്പറ്റോസെല്ലുലാർ കാർസിനോമ (LIHC), വൃക്ക വൃക്കസംബന്ധമായ പാപ്പില്ലറി സെൽ കാർസിനോമ (KIRP), കോളൻ അഡിനോകാർസിനോമ (COAD) (p മൂല്യം <0.05) (ചിത്രം 1e-m) . ജോടിയാക്കിയ ആരോഗ്യമുള്ള/ട്യൂമർ സാമ്പിളുകളുടെ വിശകലനം, ബ്ലാഡർ യൂറോതെലിയൽ കാർസിനോമ (BLCA), കിഡ്‌നി റെനൽ ക്ലിയർ സെൽ കാർസിനോമ (KIRC), പ്രോസ്റ്റേറ്റ് അഡിനോകാർസിനോമ (PRAD), ശ്വാസകോശ സ്‌ക്വാമസ് സെൽ കാർസിനോമ (LUSC) എന്നിവയുടെ മുഴകളിൽ DARS-AS1 ന്റെ ഉയർന്ന പ്രകടനത്തെ കൂടുതൽ സ്ഥിരീകരിച്ചു. , ഗർഭാശയ കോർപ്പസ് എൻഡോമെട്രിയൽ കാർസിനോമ (UCEC), ശ്വാസകോശ അഡിനോകാർസിനോമ (LUAD), കരൾ ഹെപ്പറ്റോസെല്ലുലാർ കാർസിനോമ (LIHC), വൃക്ക വൃക്കസംബന്ധമായ പാപ്പില്ലറി സെൽ കാർസിനോമ (KIRP), കോളൻ അഡിനോകാർസിനോമ (COAD) (p മൂല്യം <0.05) (ചിത്രം 1e-m) .ജോടിയാക്കിയ ആരോഗ്യമുള്ള/ട്യൂമർ സാമ്പിളുകളുടെ വിശകലനം ബ്ലാഡർ യൂറോതെലിയൽ കാർസിനോമ (BLCA), ക്ലിയർ സെൽ റീനൽ ആൻഡ് റീനൽ സെൽ കാർസിനോമ (KIRC), പ്രോസ്റ്റേറ്റ് അഡിനോകാർസിനോമ (PRAD), ലംഗ് സ്ക്വമസ് സെൽ കാർസിനോമ (LUSC) ട്യൂമറുകളിൽ DARS-AS1 ന്റെ ഉയർന്ന പ്രകടനവും സ്ഥിരീകരിച്ചു., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , എൻഡോമെട്രിയൽ കാർസിനോമ ഓഫ് ദി കോർപ്പസ് യൂട്ടറി (UCEC), ശ്വാസകോശത്തിലെ അഡിനോകാർസിനോമ (LUAD), കരളിന്റെ ഹെപ്പറ്റോസെല്ലുലാർ കാർസിനോമ (LIHC), കിഡ്നിയുടെ പാപ്പില്ലറി സെൽ കാർസിനോമ (KIRP), കോളന്റെ അഡിനോകാർസിനോമ (COAD) (p മൂല്യം < 0.05) (ചിത്രം 1e- m) .:显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 内膜 (UCEC), 肺腺癌 (LUAD), 肝肝 细胞癌 (LIRP), 肾 肾 乳头状 细胞癌 (കിർപ്പ്) 和结肠腺癌 (COAD) (P <0.05）（图1e-m） .配 对 健康 / 肿瘤样本 分析 证实 了 Dars-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌, 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 (prad), 细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 更癌 (കിർപ്) (കോഡ്）)ആരോഗ്യമുള്ള/ട്യൂമർ ജോടിയാക്കിയ സാമ്പിളുകളുടെ വിശകലനം ബ്ലാഡർ യൂറോതെലിയൽ കാർസിനോമ (BLCA), ക്ലിയർ സെൽ റീനൽ സെൽ കാർസിനോമ (KIRC), പ്രോസ്റ്റേറ്റ് അഡിനോകാർസിനോമ (PRAD), ശ്വാസകോശ സ്ക്വമസ് സെൽ കാർസിനോമ (LUSC) ട്യൂമറുകൾ എന്നിവയിൽ DARS-AS1 ന്റെ പങ്ക് കൂടുതൽ പിന്തുണച്ചു.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -എം). കോർപ്പസ് ഗർഭാശയ കാർസിനോമ (UCEC), ശ്വാസകോശ അഡിനോകാർസിനോമ (LUAD), ഹെപ്പറ്റോസെല്ലുലാർ കാർസിനോമ (LIHC), വൃക്കസംബന്ധമായ പാപ്പില്ലറി സെൽ കാർസിനോമ (KIRP), കോളൻ അഡിനോകാർസിനോമ (COAD) (p മൂല്യം <0.05) (ചിത്രം 1e -m).ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് DARS-AS1 പലതരം അർബുദങ്ങളിൽ വ്യാപകവും ഉയർന്നതുമാണ്.
DARS-AS1 ഉം DARS ഉം (ആന്റിസെൻസ് സ്ട്രാൻഡിനെ എൻകോഡിംഗ് ചെയ്യുന്ന ജീൻ) ഒരേ പ്രൊമോട്ടർ പങ്കിടുകയും പരസ്പരം അടുത്ത് സ്ഥിതിചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നതിനാൽ, ഞങ്ങൾ SHRNA രൂപകല്പന ചെയ്തത് DARS-AS1-നെ പ്രത്യേകമായി നോക്ക്ഡൗൺ ചെയ്യാനാണ്, പക്ഷേ DARS അല്ല (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 2a,b, സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 2 ) .SW620-ന് പുറമേ, shRNA നോക്ക്ഡൗണിന്റെ (സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 3) ഫലപ്രാപ്തിയും പ്രവർത്തനവും പഠിക്കാൻ ഞങ്ങൾ DARS-AS1 വളരെ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന മറ്റ് മൂന്ന് സെൽ ലൈനുകളും ഉപയോഗിച്ചു.വികസിപ്പിച്ച മൂന്ന് shRNA-കളും DARS mRNA യുടെ അളവിൽ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്താതെ കുറഞ്ഞത് 80% DARS-AS1 നോക്ക്ഡൗൺ കാര്യക്ഷമത കൈവരിച്ചതായി ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 2c-f).കൂടാതെ, ഈ shRNA-കളുമായുള്ള DARS-AS1 നോക്ക്ഡൗൺ SW620 (49.7%), HCT116 (27.7%), സ്തനാർബുദ സെൽ ലൈൻ MBA-MD-231 (53.4%) എന്നിവയിലെ കോശവളർച്ചയെ ഗണ്യമായി തടയുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.) കൂടാതെ HepG2 ഹെപ്പറ്റോമ സെൽ ലൈൻ (92.7% റിഡക്ഷൻ), അതുപോലെ ആങ്കർ ചെയ്യാത്ത ഗോളങ്ങൾ രൂപപ്പെടുത്താനുള്ള അവയുടെ കഴിവ് (ശരാശരി കുറവ് ~50.8%, 44.6%, 40.7%, 75.7% ഓരോ സെൽ ലൈനിനും) (ചിത്രം. 2a,b).SW620-ൽ, കോളനി രൂപീകരണ പരിശോധനയുടെ ഫലങ്ങൾ DARS-AS1 shRNA കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെ ഗണ്യമായി തടഞ്ഞു, ഏകദേശം 69.6% (ചിത്രം 2c) കുറയുന്നു.
SW620, HCT116, MBA-MD-231, HepG2 സെല്ലുകളിലെ സെൽ പ്രൊലിഫെറേഷൻ (എ), സ്‌ഫെറോയിഡ് രൂപീകരണം (ബി) എന്നിവയിൽ നിയന്ത്രണ shRNA, DARS-AS1 shRNA എന്നിവയുടെ പ്രഭാവം.c SW620 സെല്ലുകളിലെ കോളനി രൂപീകരണത്തിൽ നിയന്ത്രണ shRNA, DARS-AS1 shRNA എന്നിവയുടെ പ്രഭാവം.DARS-AS1 അമിതമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന SW620 സെല്ലുകളുടെ സെൽ പ്രൊലിഫെറേഷൻ (ഡി), സ്‌ഫെറോയിഡ് രൂപീകരണം (ഇ), കോളനി രൂപീകരണം (എഫ്).മൂന്ന് പരീക്ഷണങ്ങളുടെ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനാണ് കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഡാറ്റ.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ഒപ്പം *** p ≤ 0.001 - ടു ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി-ടെസ്റ്റ്.
പ്രവർത്തനരഹിതമായ പഠനങ്ങൾ പൂർത്തിയാക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ അടുത്തതായി DARS-AS1 (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2g) അമിതമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന SW620 സെല്ലുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു.DARS-AS1 ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ, SW620 സെല്ലുകളിലെ കോശവളർച്ച (1.8-മടങ്ങ്), ആങ്കർ ചെയ്യാത്ത ഗോളാകൃതി (1.4-മടങ്ങ്), കോളനി രൂപീകരണം (3.3-മടങ്ങ്) എന്നിവ വർദ്ധിപ്പിച്ചു (ചിത്രം. 2d-f).മറ്റൊരു DARS-AS1 എക്സ്പ്രസിംഗ് സെൽ ലൈൻ, A549 ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ ഈ ഫലം സ്ഥിരീകരിച്ചു.DARS-AS1 ഓവർ എക്‌സ്‌പ്രഷൻ മൂലമുള്ള ഈ മെച്ചപ്പെടുത്തിയ സെൽ വ്യാപനം A549 സെല്ലുകളിൽ കൂടുതൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 2h, i, അനുബന്ധ പട്ടിക 3).ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഈ നേട്ടവും നഷ്ടവും പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് DARS-AS1 വിട്രോയിലെ കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു എന്നാണ്.
DARS-AS1 സെൽ വ്യാപനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന അടിസ്ഥാന സംവിധാനം പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യാൻ, അതിന്റെ പ്രോട്ടീൻ-ബൈൻഡിംഗ് പങ്കാളികളെ തിരിച്ചറിയാൻ ഞങ്ങൾ ഒരു RNA പുൾ-ഡൗൺ വിശകലനം നടത്തി.RT-qPCR ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് ഏകദേശം 86.2% DARS-AS1 SW620 സെല്ലുകളുടെ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിലാണ് (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 3a).ഇൻ വിട്രോ ട്രാൻസ്‌ക്രൈബുചെയ്‌ത ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് DARS-AS1 അല്ലെങ്കിൽ pseudoRNA പിന്നീട് SW620 സെൽ ലൈസേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും തുടർന്ന് SDS-PAGE വേർതിരിക്കുകയും ചെയ്തു.DARS-AS1 പുൾ സാമ്പിളുകളിൽ ഒരു പ്രത്യേക ബാൻഡ് (~38 kDa) ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമാക്കിയിട്ടുണ്ടെന്ന് തുടർന്നുള്ള സിൽവർ സ്റ്റെയിനിംഗ് കാണിച്ചു, എന്നാൽ ഡമ്മി RNA അല്ലെങ്കിൽ ബീഡ് സാമ്പിളുകളിൽ (ചിത്രം 3a).ഈ ബാൻഡ് മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (MS) വഴി PKR ആക്റ്റിവേറ്റിംഗ് പ്രോട്ടീൻ (PACT) ആയി തിരിച്ചറിയുകയും SW620, HCT116, HepG2 സെൽ ലൈനുകളിൽ (ചിത്രം 3a,b) ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി സ്ഥിരീകരിക്കുകയും ചെയ്തു.DARS-ന്റെയും അനുബന്ധ PACT പ്രോട്ടീനുകളുടെയും - PKR, TRBP എന്നിവയുടെ സമ്പുഷ്ടീകരണവും വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് (WB) വഴി RNA വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് അന്വേഷിച്ചു.DARS-AS1 RNA യും ഈ മൂന്ന് പ്രോട്ടീനുകളും തമ്മിൽ നേരിട്ടുള്ള ഇടപെടലുകളൊന്നും കണ്ടെത്തിയിട്ടില്ലെന്ന് ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 3b).DARS-AS1 ഉം PACT ഉം തമ്മിലുള്ള നിർദ്ദിഷ്ട ഇടപെടൽ RNA ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷൻ (RIP) വിശകലനം വഴി കൂടുതൽ സ്ഥിരീകരിച്ചു, ഇത് DARS-AS1 ആന്റി-PACT ആന്റിബോഡികളിൽ ഗണ്യമായി സമ്പുഷ്ടമാണെന്നും എന്നാൽ മറ്റ് നിയന്ത്രണ RNA-കളല്ലെന്നും കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 3c).മറ്റേതെങ്കിലും സെല്ലുലാർ ഘടകങ്ങളുടെ അഭാവത്തിൽ DARS-AS1 PACT-മായി നേരിട്ട് ഇടപഴകുന്നുണ്ടോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ, ശുദ്ധീകരിച്ച PACT ഉപയോഗിച്ച് ഒരു ഇൻ വിട്രോ ബയോലെയർ ഇന്റർഫെറോമെട്രി (BLI) പരിശോധന നടത്തി.ബയോട്ടിൻ-ലേബൽ ചെയ്ത DARS-AS1 അല്ലെങ്കിൽ ഡമ്മി RNA സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ (SA) ബയോസെൻസറുകളിൽ നിശ്ചലമാക്കുകയും തുടർന്ന് 1 μM PACT അടങ്ങുന്ന കൈനറ്റിക് ബഫറിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.ശ്രദ്ധേയമായി, PACT DARS-AS1 (KD മൂല്യം ~26.9 nM) ലേക്ക് ശക്തമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, എന്നാൽ RNA യെ അനുകരിക്കുന്നില്ല (ചിത്രം 3d).ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ DARS-AS1 ഉം PACT ഉം തമ്മിലുള്ള നേരിട്ടുള്ള ഇടപെടലും ഉയർന്ന ബന്ധവും പ്രകടമാക്കുന്നു.
RNA പുൾ വിശകലനം DARS-AS1 SW620 സെല്ലുകളിൽ PACT-മായി ഇടപഴകുന്നതായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു.മുകളിൽ, ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളുടെ സിൽവർ സ്റ്റെയിനിംഗ്.ആന്റി-PACT ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ലോവർ ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടുകൾ നടത്തി.b RNA പുൾ-ഡൗൺ വിശകലനം HCT116 (മുകളിൽ), HepG2 (താഴെ) സെല്ലുകളിൽ നടത്തി.ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി PACT സമ്പുഷ്ടീകരണം കണ്ടെത്തി.സൂചിപ്പിച്ച ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് SW620 സെല്ലുകളിൽ cRNA immunoprecipitation (RIP) പരിശോധനകൾ നടത്തി.d PACT ബൈൻഡിംഗ് കർവുകൾ പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ള DARS-AS1 അല്ലെങ്കിൽ കൺട്രോൾ RNA ലേക്ക് ബയോലെയർ ഇന്റർഫെറോമെട്രി (BLI) ഉപയോഗിച്ച് ലഭിച്ചു.സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ ബയോസെൻസറിൽ ആർഎൻഎ നിശ്ചലമാക്കി.അസോസിയേഷൻ അളക്കാൻ 1 μM PACT ഉപയോഗിച്ചു.ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് മുഴുനീള DARS-AS1 അല്ലെങ്കിൽ വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ (മുകളിൽ) ഉപയോഗിച്ചാണ് e RNA പുൾ അസ്സേ നടത്തിയത്.PACT സ്വീകരിച്ചത് (ചുവടെ) കാണിക്കുന്ന ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ട്f പ്യൂരിഫൈഡ് ഫ്ലാഗുചെയ്‌ത PACT, ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ഫുൾ-ലെംഗ്ത്ത് DARS-AS1 ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്‌തു അല്ലെങ്കിൽ ഇൻ വിട്രോ RIP പരിശോധനയ്‌ക്കായി വെട്ടിച്ചുരുക്കി (e-ൽ ഉള്ളതുപോലെ).വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNA RT-qPCR പരിശോധിച്ചുറപ്പിച്ചു.g PACT-നുള്ള വ്യത്യസ്ത RNA ശകലങ്ങളുടെ ആപേക്ഷിക ബന്ധം ബയോലെയർ ഇന്റർഫെറോമെട്രി ഉപയോഗിച്ചാണ് ലഭിച്ചത്.വിശകലനത്തിനായി, 100 nM RNA, 1 μM RAST എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചു.h ഇൻ വിട്രോ RIP പരിശോധനകൾ ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെട്ട കേടുപാടുകൾ കൂടാതെ അല്ലെങ്കിൽ വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ PACT എന്ന ലേബൽ ഉപയോഗിച്ചാണ് നടത്തിയത്.വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNA RT-qPCR പരിശോധിച്ചുറപ്പിച്ചു.i DARS-AS1, PACT അല്ലെങ്കിൽ രണ്ടും അമിതമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന SW620 സെല്ലുകളുടെ വളർച്ചാ നിരക്ക്.j SW620 സെല്ലുകളിലെ പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ളതോ വെട്ടിച്ചുരുക്കിയതോ ആയ DARS-AS1 ന്റെ അമിതമായ എക്സ്പ്രഷൻ കോശ വളർച്ചയിൽ വ്യത്യസ്തമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തി.k ആന്റി-PARP ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് നടത്തിയാണ് അപ്പോപ്റ്റോസിസ് കണ്ടെത്തിയത്.ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി കാണിക്കുന്നത് പോലെ DARS-AS1 ന്റെ നോക്കൗട്ട് SW620 സെല്ലുകളുടെ അപ്പോപ്റ്റോസിസിനെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു.മൂന്ന് പരീക്ഷണങ്ങളുടെ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനാണ് കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഡാറ്റ. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, ടു ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി ടെസ്റ്റ് വഴി. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, ടു ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി ടെസ്റ്റ് വഴി. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 by two-tailed Student's t-test. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 by two-tailed Student's t-test.
PACT അസോസിയേഷന് ആവശ്യമായ DARS-AS1 റീജിയൻ തിരിച്ചറിയുന്നതിനായി ഞങ്ങൾ ഇൻ വിട്രോ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ വഴി മൂന്ന് ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് DARS-AS1 RNA ശകലങ്ങൾ സൃഷ്ടിച്ചു (ചിത്രം 3e).ഓരോ ശകലത്തിനും PACT-മായി ഇടപഴകാൻ കഴിയുമെന്ന് RNA വിശകലന ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചു, എന്നാൽ 3′-ടെർമിനൽ മേഖല (384-768 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ A3 എന്ന് ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്നു) A1 എന്ന് ലേബൽ ചെയ്ത 1-384 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ (ചിത്രം 3e) കാണിക്കുന്നു.റീകോമ്പിനന്റ് PACT (ചിത്രം 3f) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻ വിട്രോ RIP പരിശോധനയിൽ സമാനമായ ഫലങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.ഈ ഫലങ്ങൾക്ക് അനുസൃതമായി, BLI ഉപയോഗിച്ച് PACT ലേക്ക് നിശ്ചലമായ RNA ശകലങ്ങൾ ബൈൻഡ് ചെയ്യുന്നതിനുള്ള പരീക്ഷണങ്ങൾ, PACT ന് A3 (384–768 nt) (ഏകദേശം 94.6 nM-ന്റെ KD മൂല്യം) യുമായി കൂടുതൽ അടുപ്പമുണ്ടെന്ന് കാണിക്കുന്നു, അതേസമയം മറ്റ് മേഖലകളുമായി മിക്കവാറും ബന്ധമില്ല.(ചിത്രം 3d).
PACT-ൽ ബന്ധപ്പെട്ട ബൈൻഡിംഗ് മേഖലകളും ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.PACT-ൽ മൂന്ന് ഫങ്ഷണൽ ഡൊമെയ്‌നുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, അവയിൽ രണ്ടെണ്ണം സംരക്ഷിത ഡബിൾ സ്‌ട്രാൻഡഡ് ആർഎൻഎ-ബൈൻഡിംഗ് ഡൊമെയ്‌നുകളും (ഡിഎസ്ആർബിഡി) പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളുടെ ആക്‌റ്റിവേറ്ററായി പ്രവർത്തിക്കുന്ന മൂന്നാമത്തെ ഡൊമെയ്‌നും (നിയോഗിക്കപ്പെട്ട ഡി 3) ആണ്.ഓരോ ഡൊമെയ്‌നിന്റെയും lncRNA ബൈൻഡിംഗ് കപ്പാസിറ്റി പരിശോധിക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ മൂന്ന് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തു, അത് മൂന്ന് ഡൊമെയ്‌നുകളിൽ ഓരോന്നും നീക്കം ചെയ്യുകയും ഇൻ വിട്രോ RIP പരിശോധന നടത്തുകയും ചെയ്തു.മറ്റ് രണ്ട് മ്യൂട്ടേഷനുകളെ അപേക്ഷിച്ച് (ചിത്രം 3h) PACT യുടെ മൂന്നാം ഡൊമെയ്‌ൻ (D3) ഇല്ലാതാക്കുന്നത് DARS-AS1-മായുള്ള അതിന്റെ ഇടപെടൽ ഗണ്യമായി കുറച്ചതായി ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചു (അക്ഷമമായ PACT-യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ 0.11 മടങ്ങ്). D3 യുടെ DARS-മായി സംവദിച്ചു.-എസി1.ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് DARS-AS1 ഉം PACT ഉം തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം പ്രാഥമികമായി DARS-AS1 ന്റെ 3′ അവസാനത്തിലൂടെയും PACT ന്റെ D3 ഡൊമെയ്‌നിലൂടെയും സംഭവിക്കാം എന്നാണ്.
PACT എക്‌സ്‌പ്രഷനിൽ DARS-AS1-ന് യാതൊരു സ്വാധീനവും ഇല്ലെന്നും PACT-ന് DARS-AS1-ൽ യാതൊരു സ്വാധീനവും ഇല്ലെന്നും ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 3c).സെൽ വളർച്ചയിൽ PACT നോക്ക്ഡൗണിന്റെ പ്രഭാവം ഞങ്ങൾ പിന്നീട് പരിശോധിച്ചു.DARS-AS1 ന് വിപരീതമായി, PACT ഇടിച്ചപ്പോൾ ആപേക്ഷിക കോശങ്ങൾ 1.5-3 മടങ്ങ് വേഗത്തിൽ വളർന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 3d).കോളനി രൂപീകരണ പരിശോധനയുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, PACT (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 3e) ഉപയോഗിച്ചുള്ള shRNA ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം കോശങ്ങൾ 2-3 മടങ്ങ് കോളനികൾ രൂപപ്പെട്ടു എന്നാണ്.PACT വഴി DARS-AS1 സെൽ വ്യാപനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ, PACT, DARS-AS1 അല്ലെങ്കിൽ രണ്ടും അമിതമായി പ്രകടമാക്കുന്ന SW620 സെല്ലുകൾ ഞങ്ങൾ സൃഷ്ടിച്ചു.PACT ന്റെ അമിതമായ എക്സ്പ്രഷൻ കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെ ഗണ്യമായി തടയുന്നു (ചിത്രം 3i).DARS-AS1 ഓവർ എക്‌സ്‌പ്രഷൻ കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെ ഗണ്യമായി പ്രോത്സാഹിപ്പിച്ചപ്പോൾ, DARS-AS1, PACT എന്നിവ അമിതമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന സെല്ലുകളുടെ വളർച്ചാ നിരക്കിൽ കാര്യമായ വ്യത്യാസമില്ല.DARS-AS1 ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ മൂലമുണ്ടാകുന്ന വർദ്ധിച്ച വ്യാപനത്തെ PACT പ്രതിരോധിച്ചേക്കാമെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
DARS-AS1 ന്റെ വിവിധ മേഖലകൾക്ക് വ്യത്യസ്ത PACT-ബൈൻഡിംഗ് കഴിവുകൾ ഉള്ളതിനാൽ, DARS-AS1 ശകലങ്ങളുടെ വ്യത്യസ്തമായ അമിതമായ എക്സ്പ്രഷൻ വഴി സെൽ വ്യാപനത്തിൽ അവയുടെ ആപേക്ഷിക സ്വാധീനം ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു.മറ്റ് രണ്ട് ശകലങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, DARS-AS1 3′ അവസാനം (384–768 nt), DARS-AS1-ലെ പ്രധാന PACT-മായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രദേശം, കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും ഉയർന്ന കഴിവുള്ള പ്രദേശം (ചിത്രം 3j).ഈ ഫലങ്ങൾ DARS-AS1-ന്റെ ബൈൻഡിംഗ് കപ്പാസിറ്റിയും ബയോളജിക്കൽ ഫംഗ്‌ഷനും തമ്മിലുള്ള നല്ല ബന്ധത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
PACT ഒരു പ്രോ-അപ്പോപ്റ്റോട്ടിക് പ്രോട്ടീനാണെന്ന് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്19.അതിനാൽ, അപ്പോപ്റ്റോസിസിൽ DARS-AS1 ന്റെ പ്രഭാവം ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു.പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, DARS-AS1 knockdown SW620 സെല്ലുകളിൽ PARP പിളർപ്പ് ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും SW620, HCT116, HepG2, MBA-MD-231 സെൽ ലൈനുകളിലെ അനെക്സിൻ V- പോസിറ്റീവ് സെല്ലുകളുടെ അനുപാതം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം 3k).3).3f-h), ക്യാൻസർ കോശങ്ങളിലെ DARS-AS1-ന്റെ ആന്റി-അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് പ്രഭാവം PACT-ന്റെ അപ്പോപ്‌ടോസിസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്ന പ്രവർത്തനത്തിന് വിപരീതമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് DARS-AS1 ഓങ്കോജെനിക് ഫംഗ്‌ഷന്റെ സംവിധാനം PACT ഫംഗ്‌ഷനെ തടയുന്നതിലൂടെയാകാം എന്നാണ്.
അടുത്തതായി, DARS-AS1-PACT അസോസിയേഷന്റെ പ്രവർത്തനപരമായ പ്രത്യാഘാതങ്ങൾ ഞങ്ങൾ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്തു.നേരിട്ടുള്ള ഇടപെടലിലൂടെ PKR സജീവമാക്കുന്നതായി PACT റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, ഇത് പിന്നീട് eIF2α ഫോസ്‌ഫോറിലേഷൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും വിവർത്തന ഇല്ലാതാക്കലിനും അപ്പോപ്‌ടോസിസിനും കാരണമാകുകയും ചെയ്യുന്നു.ആദ്യം, PACT, PKR എന്നിവയുടെ സെല്ലുലാർ പ്രാദേശികവൽക്കരണത്തെ DARS-AS1 ബാധിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.0.72 ശരാശരി പിയേഴ്‌സൺ കോറിലേഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റ് ഉള്ള SW620 സെല്ലുകളിൽ PACT ഉം PKR ഉം വളരെ കോലോക്കലൈസ് ചെയ്തിട്ടുണ്ടെന്ന് കോൺഫോക്കൽ ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പി കാണിച്ചു.അതേസമയം, DARS-AS1 ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ PACT, PKR കോ-ലോക്കലൈസേഷനെ ഗണ്യമായി കുറച്ചു (അർത്ഥം പിയേഴ്സൺ കോറിലേഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റ് 0.61) (ചിത്രം 4a).DARS-AS1 ന് PACT-PKR ഇടപെടൽ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമോ എന്ന് അന്വേഷിക്കാൻ, SW620 സെൽ ലൈസേറ്റുകളിൽ ആന്റി-PACT ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ ഒരു കോ-ഇമ്യൂണോപ്രിസിപിറ്റേഷൻ (കോ-ഐപി) പരിശോധന നടത്തി.കൺട്രോൾ സെല്ലുകളിലെ ആന്റി-PACT-ൽ PKR വളരെയധികം സമ്പുഷ്ടമായിരുന്നു, അതേസമയം DARS-AS1 (ചിത്രം 4b) അമിതമായി പ്രകടമാക്കുന്ന സെല്ലുകളിൽ നിന്നുള്ള ലൈസെറ്റുകളിൽ PKR വീണ്ടെടുക്കൽ ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു.ശുദ്ധീകരിച്ച ലേബൽ ചെയ്ത PACT, PKR എന്നിവ ഇൻ വിട്രോ പ്രോട്ടീൻ ബൈൻഡിംഗ് പരിശോധനകൾക്കായി ഉപയോഗിച്ചു.അതനുസരിച്ച്, DARS-AS1 നൽകിയവയും എന്നാൽ നിയന്ത്രണ RNA ഇല്ലാതിരുന്ന PACT-PKR ഇടപെടലും കാണിച്ചില്ല (ചിത്രം 4c).എല്ലാ ഫലങ്ങളും DARS-AS1 PACT, PKR ആശയവിനിമയത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തിയതായി കാണിച്ചു.
കൺട്രോൾ സെല്ലുകളിലോ DARS-AS1 അമിതമായി പ്രകടമാക്കുന്ന സെല്ലുകളിലോ PACT, PKR എന്നിവയുടെ കോ-ലോക്കലൈസേഷൻ കൺഫോക്കൽ ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് നിരീക്ഷിച്ചു.അണുകേന്ദ്രങ്ങൾ ഡിഎപിഐ ഉപയോഗിച്ച് കളങ്കപ്പെട്ടു.16 ഫോട്ടോകളിൽ നിന്ന് സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചു.b കൺട്രോൾ SW620 സെല്ലുകളിലോ DARS-AS1 അമിതമായി പ്രകടമാക്കുന്ന സെല്ലുകളിലോ ഉള്ള സെൽ ലൈസേറ്റുകളിൽ ആന്റി-PACT ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ചുള്ള കോ-ഇമ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷൻ (co-IP).c ലേബൽ ചെയ്‌ത PACT, ശുദ്ധീകരിച്ച PKR, DARS-AS1 അല്ലെങ്കിൽ മോക്ക് RNA ഉപയോഗിച്ച് വിട്രോയിൽ ട്രാൻസ്‌ക്രൈബ് ചെയ്‌തത് ഇൻ വിട്രോ പ്രോട്ടീൻ ബൈൻഡിംഗ് വിശകലനത്തിനായി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്‌തു.ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷനായി ആന്റി-ഫ്ലാഗ് ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ചു.d സൂചിപ്പിച്ച ആന്റിബോഡികളുള്ള ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടുകൾ SW620, HCT116 സെല്ലുകളിൽ കൺട്രോൾ shRNA അല്ലെങ്കിൽ DARS-AS1-shRNA ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ടു, തുടർന്ന് സെറം പട്ടിണിയും.e DARS-AS1 എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ ടാപ്സിഗാർജിനിലേക്കുള്ള സെല്ലുലാർ സെൻസിറ്റിവിറ്റിയിൽ മാറ്റം വരുത്തി.SW620 സെല്ലുകൾ DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ പ്ലാസ്മിഡ് അല്ലെങ്കിൽ കൺട്രോൾ പ്ലാസ്മിഡ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ടു.കോശങ്ങളെ 48 മണിക്കൂർ ടാപ്‌സിഗാർജിൻ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുകയും എംടിഎസ് റീജന്റ് ഉപയോഗിച്ച് സെൽ പ്രവർത്തനക്ഷമത നിർണ്ണയിക്കുകയും ചെയ്തു.എഫ് ഇൻ വിട്രോ ട്രാൻസ്‌ക്രൈബുചെയ്‌ത DARS-AS1 അല്ലെങ്കിൽ ഡമ്മി ആർഎൻഎ, ശുദ്ധീകരിച്ച PACT എന്നിവ ഇൻ വിട്രോ ആക്ടിവേഷൻ അസെയ്‌ക്കും ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ട് കണ്ടെത്തലിനും ഉപയോഗിച്ചു.g ഈ ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടുകൾ SW620-ctrl സെല്ലുകളിലോ (ഇടത്) അല്ലെങ്കിൽ PKR മ്യൂട്ടന്റുകളെ (വലത്) അമിതമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കോശങ്ങളിലോ നടത്തി.ഈ കോശങ്ങൾ പിന്നീട് കൺട്രോൾ shRNA അല്ലെങ്കിൽ DARS-AS1-shRNA ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ടു, തുടർന്ന് സെറം പട്ടിണി.h ഫ്ലോ സൈറ്റോമെട്രി കാണിക്കുന്നത് രൂപാന്തരപ്പെട്ട PKR-ന്റെ പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കൽ SW620 സെല്ലുകളിലെ DARS-AS1-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് അപ്പോപ്‌ടോസിസിന് നഷ്ടപരിഹാരം നൽകുന്നു എന്നാണ്.i സൂചിപ്പിച്ച ആന്റിബോഡികളുള്ള ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടുകൾ SW620 (ഇടത്) അല്ലെങ്കിൽ HCT116 (വലത്) സെല്ലുകളിൽ നടത്തി.കൺട്രോൾ shRNA അല്ലെങ്കിൽ DARS-AS1 shRNA ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടുന്ന സെല്ലുകൾ സെറം ഇല്ലാത്തവയാണ്, കൂടാതെ 100 nM PKR C16 ഇൻഹിബിറ്റർ അല്ലെങ്കിൽ DMSO ഉപയോഗിച്ച് സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്യുന്നു.സ്കെയിൽ ബാർ = 5 µm.മൂന്ന് പരീക്ഷണങ്ങളുടെ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനാണ് കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഡാറ്റ.* p ≤ 0.05 ടു ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി-ടെസ്റ്റ്.
PACT PKR17-മായി സംവദിച്ചാൽ, Thr451-ൽ PKR ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ പ്രേരിപ്പിക്കപ്പെടുമെന്ന് പൊതുവെ വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു.സെറം പട്ടിണിക്ക് ശേഷം DARS-AS1 നോക്ക്ഡൗൺ സെല്ലുകളിൽ PKR ഫോസ്ഫോറിലേഷന്റെ അളവ് ഗണ്യമായി ഉയർന്നതായി ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 4d, അനുബന്ധ ചിത്രം 4a).അതനുസരിച്ച്, പ്രധാന PKR അടിവസ്ത്രമായ eIF2α യുടെ ഫോസ്‌ഫോറിലേഷനും DARS-AS1 shRNA (ചിത്രം 4d, അനുബന്ധ ചിത്രം 4a) ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.Tapsigargin ഒരു ER സ്ട്രെസറാണ്, ഇത് ER Ca2+ പുറത്തുവിടാൻ കാരണമാകുന്നു.ടാപ്‌സിഗാർജിൻ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ PACT-ന്റെ ആവിഷ്‌കാരവും സജീവമാക്കലും പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, ഇത് പികെആറുമായി കൂടുതൽ സംവദിക്കുകയും സജീവമാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് eIF2α ഫോസ്‌ഫോറിലേഷൻ 18,61 വർദ്ധിപ്പിച്ച് അപ്പോപ്‌ടോസിസിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.ഇവിടെ, PACT/PKR പാത്ത്‌വേയെ തടഞ്ഞുകൊണ്ട് സമ്മർദ്ദത്തെ മറികടക്കാൻ കോശങ്ങളെ സഹായിക്കാൻ DARS-AS1-ന് കഴിയുമോ എന്ന് അന്വേഷിക്കാൻ ഞങ്ങൾ PACT/PKR പാതയുടെ ഉത്തേജകമായി ടാപ്‌സിഗാർജിൻ ഉപയോഗിച്ചു.DARS-AS1 പദപ്രയോഗത്തിന്റെ നിലവാരം ടാപ്‌സിഗാർജിനോടുള്ള സെൽ പ്രതിരോധവുമായി നല്ല ബന്ധമുള്ളതായി ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.DARS-AS1 അമിതമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന SW620 സെല്ലുകൾ ടാപ്‌സിഗാർജിൻ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുമ്പോൾ മികച്ച രീതിയിൽ അതിജീവിച്ചു, അതേസമയം DARS-AS1 നോക്ക്ഡൗൺ ഉള്ള സെല്ലുകൾ കൂടുതൽ രോഗസാധ്യതയുള്ളതായി മാറി (ചിത്രം 4e).ഈ ഫലങ്ങൾക്ക് അനുസൃതമായി, DARS-AS1 ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ ടാപ്സിഗാർജിൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് PKR ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ കുറച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4b).നേരെമറിച്ച്, തപ്സിഗാർജിൻ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം, നിയന്ത്രണ സെല്ലുകളെ അപേക്ഷിച്ച് DARS-AS1 നോക്ക്ഡൗൺ സെല്ലുകളിൽ PKR, eIF2α എന്നിവ ഉയർന്ന അളവിൽ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്യപ്പെട്ടു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4b).രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ടാപ്‌സിഗാർജിൻ DARS-AS1 എക്‌സ്‌പ്രഷൻ ഒരു ഡോസ്-ആശ്രിത രീതിയിൽ പ്രേരിപ്പിച്ചു, ഇത് DARS-AS1-ന്റെ സമ്മർദ്ദ വിരുദ്ധ പ്രവർത്തനത്തെ സൂചിപ്പിക്കാം (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4c).കൂടാതെ, ഈ നിരീക്ഷണങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ ഇൻ വിട്രോ ആക്ടിവേഷൻ അസ്സെകൾ നടത്തി.ചുരുക്കത്തിൽ, പികെആർ ആന്റി-പികെആർ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് സെൽ ലൈസേറ്റുകളിൽ നിന്ന് ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെട്ടു, തുടർന്ന് വിട്രോയിൽ ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്ത റീകോമ്പിനന്റ് PACT, DARS-AS1 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.എൻസൈമാറ്റിക് പ്രതികരണത്തിന് ശേഷം, WB ഉപയോഗിച്ച് ഫോസ്ഫോ-പികെആർ കണ്ടെത്തി.DARS-AS1 വഴി PKR ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ ഗണ്യമായി തടഞ്ഞുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിച്ചു, എന്നാൽ നിയന്ത്രണ RNA വഴിയല്ല (ചിത്രം 4f).ഈ ഇൻ വിട്രോ, ഇൻ വിവോ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് DARS-AS1 PACT-മെഡിയേറ്റഡ് PKR ആക്ടിവേഷനെ തടയുന്നു എന്നാണ്.അതേ സമയം, DARS-AS1 (ചിത്രം 4f) ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ PACT വീണ്ടെടുക്കൽ കുറയുന്നതും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.ഈ ഫലം ഇൻ വിട്രോ പ്രോട്ടീൻ ബൈൻഡിംഗ് അസെയുടെ (ചിത്രം 4c) ഫലങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ PACT-PKR അസോസിയേഷനുള്ള DARS-AS1-ന്റെ തടയൽ പ്രവർത്തനത്തെ വീണ്ടും വ്യക്തമാക്കുന്നു.
സെല്ലുലാർ സമ്മർദ്ദത്തിൽ PKR സജീവമാക്കുന്നതിന് PACT-ന്റെ D3 ഡൊമെയ്‌നിലെ Ser246, Ser287 എന്നിവ ആവശ്യമാണ്.അലനൈനിനായി രണ്ട് സെറിൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നത് മ്യൂട്ടന്റ് PACT (mutD) നൽകി, ഇത് സമ്മർദ്ദത്തിന്റെ അഭാവത്തിൽ PKR സജീവമാക്കി, അലനൈനിന് (mutA) പകരം വയ്ക്കുന്നത് പ്രോട്ടോക്കോൾ വിപരീതമാക്കി.DARS-AS1-മായി നേരിട്ട് സഹകരിച്ച് ഈ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ പ്രാധാന്യം ഞങ്ങൾ പ്രകടമാക്കിയതിനാൽ, ഈ അവശിഷ്ടങ്ങൾ DARS-AS1-യുമായുള്ള ഇടപെടലിൽ ഉൾപ്പെടുമോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ഈ രണ്ട് PACT മ്യൂട്ടന്റുകളെ സൃഷ്ടിച്ചു.കൗതുകകരമെന്നു പറയട്ടെ, DARS-AS1 (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 4d) മായി ബന്ധിപ്പിക്കാനുള്ള കഴിവ് രണ്ട് മ്യൂട്ടന്റുകൾക്കും നഷ്ടപ്പെട്ടു, ഇത് DARS-AS1-യുമായുള്ള കാര്യക്ഷമമായ ഇടപെടലിന് PACT പ്രോട്ടീന്റെ പൂർണ്ണമായ ഘടന ആവശ്യമായി വരുമെന്ന് നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.
കൂടാതെ, പ്രബലമായ നെഗറ്റീവ് PACT മ്യൂട്ടന്റ് (PACTmutA) അല്ലെങ്കിൽ ഒരു ആധിപത്യ നെഗറ്റീവ് PKR മ്യൂട്ടന്റ് (PKRmut) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4e. e) അമിതമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതിലൂടെ DARS-AS1-shRNA-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് സെൽ പ്രൊലിഫെറേഷൻ തടസ്സം ഭാഗികമായി പുനഃസ്ഥാപിക്കാമെന്നും ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ആധിപത്യ-നെഗറ്റീവ് പികെആർ മ്യൂട്ടന്റുകളുടെ ഓവർ എക്‌സ്‌പ്രഷൻ, DARS-AS1 knockdown വഴി പ്രേരിപ്പിച്ച PKR ഫോസ്‌ഫോറിലേഷനും സെറം-നഷ്ടപ്പെട്ട കോശങ്ങളിലെ eIF2α ഫോസ്‌ഫോറിലേഷനും കുറച്ചു (ചിത്രം 4g).അതിലും പ്രധാനമായി, PKRmut (ചിത്രം 4h, അനുബന്ധ ചിത്രം 4g) അമിതമായി പ്രകടമാക്കുന്ന സെല്ലുകളിൽ DARS-AS1 knockdown വഴി പ്രേരിപ്പിച്ച അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് സെല്ലുകളുടെ അനുപാതം കുറഞ്ഞു.PKR കൈനസ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ തടസ്സവും DARS-AS1 പ്രവർത്തനത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു, ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് പോലെ, DARS-AS1 നോക്ക്ഡൗൺ അപൂർവ്വമായി PKR-ഉം eIF2α ഫോസ്ഫോറിലേഷനും പ്രേരിപ്പിക്കുന്നത് PKR-നിർദ്ദിഷ്‌ട C16 ഇൻഹിബിറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് സെല്ലുകളെ ചികിത്സിക്കുമ്പോൾ (ചിത്രം 4i, അനുബന്ധ ചിത്രം 4h).).ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, PACT-മെഡിയേറ്റഡ് PKR ആക്ടിവേഷൻ തടയുന്നതിലൂടെ DARS-AS1 സെൽ വ്യാപനത്തെ ഭാഗികമായെങ്കിലും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ട്യൂമറിജെനിസിസിൽ DARS-AS1-ന്റെ പങ്ക് കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യുന്നതിനായി, ഒരു മൗസ് സെനോഗ്രാഫ്റ്റ് മോഡൽ ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ vivo പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി. DARS-AS1 ന്റെ നോക്ക്ഡൗൺ എലികളിലെ ട്യൂമർ വളർച്ച നാടകീയമായി കുറച്ചതായി ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു (p മൂല്യം <0.0001) (ചിത്രം 5a). DARS-AS1 ന്റെ നോക്ക്ഡൗൺ എലികളിലെ ട്യൂമർ വളർച്ച നാടകീയമായി കുറച്ചതായി ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു (p മൂല്യം <0.0001) (ചിത്രം 5a). രെസുല്തത്ы പൊകജ്ыവയുത്, ച്തൊ നൊക്ദൌന് DARS-AS1 രെസ്കൊ സ്നിജഎത് റോസ്റ്റ് ഒപുഹൊളി യു മൈഷെയ് (സാധാരണ p <0,0001) DARS-AS1 knockdown എലികളിലെ ട്യൂമർ വളർച്ചയെ ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കുന്നതായി ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു (p മൂല്യം <0.0001) (ചിത്രം 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）㼉（图5a）ഏകദേശം റിസൾട്ടേഷൻ പോക്കസലി, എച്ച്ടോ നോക്‌ഡൗൺ DARS-AS1 പ്രസിദ്ധീകരണ സ്‌നിഷേറ്റ് റോസ്‌റ്റ് ഓപ്പുഹോളി യു മൈഷെയ് (സാധാരണ 10,000). DARS-AS1 knockdown എലികളിലെ ട്യൂമർ വളർച്ച ഗണ്യമായി കുറച്ചതായി ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചു (p മൂല്യം <0.0001) (ചിത്രം 5a).അങ്ങനെ, DARS-AS1 knockdown ഗ്രൂപ്പിൽ, ട്യൂമർ വോളിയത്തിൽ ഏകദേശം 72.9% ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടായി, ട്യൂമർ പിണ്ഡം ഏകദേശം 87.8% ആയി കുറഞ്ഞു (ചിത്രം 5b-d).വിവോയിലെ ട്യൂമർ വളർച്ചയെ DARS-AS1 ഗണ്യമായി പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുമെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ ശക്തമായി സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
നഗ്ന എലികളിലെ കൊളോറെക്റ്റൽ ഓങ്കോജെനിസിസിൽ പരസ്യ DARS-AS1 നോക്ക്ഡൗണിന്റെ ഫലങ്ങൾ.വളർച്ചാ വളവുകൾ (എ), ട്യൂമർ വലുപ്പം (ബി), ഭാരം (സി), ട്യൂമർ ഇമേജുകൾ (ഡി) എന്നിവ കാണിക്കുന്നു.പിശക് ബാറുകൾ ± SEM പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. n = 10. ****p <0.0001, ടു ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി ടെസ്റ്റ് വഴി. n = 10. ****p <0.0001, ടു ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി ടെസ്റ്റ് വഴി. n = 10. ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p <0.0001 ടു ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി-ടെസ്റ്റ്.n = 10. ****p <0.0001,通过双尾学生t 检验。 ****p <0.0001,通过双尾学生t检验。 ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 ടു ടെയിൽഡ് സ്റ്റുഡന്റ്സ് ടി-ടെസ്റ്റ്.e Kaplan-Meier, DARS-AS1 എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലും UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, LGG എന്നിവയുള്ള രോഗികളുടെ മൊത്തത്തിലുള്ള അതിജീവനവും തമ്മിലുള്ള പരസ്പരബന്ധം വിശകലനം ചെയ്തു.രോഗികളിൽ ഉയർന്ന അളവിലുള്ള DARS-AS1 എക്സ്പ്രഷൻ ഏറ്റവും ഉയർന്ന 50% ആയിരുന്നു;രോഗികളിൽ DARS-AS1 എക്സ്പ്രഷന്റെ താഴ്ന്ന നില 50% ആണ്.ലോഗ് റാങ്ക് ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് p- മൂല്യങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു.PACT-PKR പാതയെയും ട്യൂമർ വളർച്ചയെയും DARS-AS1 നിയന്ത്രിക്കുന്ന നിർദ്ദിഷ്ട മാതൃക.
DARS-AS1-ന്റെ ക്ലിനിക്കൽ ആഘാതം നന്നായി മനസ്സിലാക്കാൻ, അതിന്റെ പ്രകടനവും രോഗിയുടെ അതിജീവനവും തമ്മിലുള്ള പരസ്പരബന്ധം ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.TCGA ഡാറ്റാസെറ്റ് വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിലൂടെ, ഉയർന്ന DARS-AS1 എക്സ്പ്രഷൻ യുവൽ മെലനോമ (UVM), വൃക്കസംബന്ധമായ ക്രോമോഫോബിയ (KICH), വൃക്കസംബന്ധമായ പാപ്പില്ലറി സെൽ കാർസിനോമ (KIRP), മെസോതെലിയോമ (MESO), മൾട്ടിപ്ലക്സ് എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.താഴ്ന്ന നിലനിൽപ്പ് ഗ്ലിയോബ്ലാസ്റ്റോമ മോർഫോസിസ് (ജിബിഎം), താഴ്ന്ന ഗ്രേഡ് ബ്രെയിൻ ഗ്ലിയോമ (എൽജിജി) ഉള്ള രോഗികളുമായി (ചിത്രം 5 ഇ) കാര്യമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് DARS-AS1 ക്ലിനിക്കൽ ട്യൂമർ പുരോഗതിയിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുമെന്നും ഒന്നിലധികം ക്യാൻസറുകളിൽ ഒരു സാധ്യതയുള്ള ബയോമാർക്കർ ആയിരിക്കാം.
ഈ പഠനത്തിൽ, വലിയ തോതിലുള്ള CRISPRi ഫംഗ്ഷണൽ സ്ക്രീനിംഗ് ഉപയോഗിച്ച്, PACT, PKR എന്നീ രണ്ട് പ്രധാന സ്ട്രെസ് റെസ്പോണ്ടർമാരെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ DARS-AS1 lncRNA ക്യാൻസർ സെൽ സമ്മർദ്ദത്തെ മറികടക്കുമെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു.PACT-മായി നേരിട്ട് ഇടപഴകുന്നതിലൂടെ, DARS-AS1, PACT-മെഡിയേറ്റഡ് PKR സജീവമാക്കൽ തടയുകയും, അതുവഴി അപ്പോപ്‌ടോട്ടിക് കോശങ്ങളുടെ മരണം തടയുകയും കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു (ചിത്രം 5f).പല തരത്തിലുള്ള ക്യാൻസറുകളിൽ DARS-AS1 ന്റെ നിയന്ത്രണങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, സമ്മർദപൂരിതമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ അതിജീവനം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള അതിന്റെ പ്രവർത്തനം ഒന്നിലധികം തരം ക്യാൻസറുകൾക്ക് വ്യാപകമായി ബാധകമാകുമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
PACT ഒരു PKR ആക്റ്റിവേറ്റർ പ്രോട്ടീനായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ, വിവർത്തനം, അപ്പോപ്റ്റോസിസ്, മറ്റ് പ്രധാനപ്പെട്ട സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകൾ എന്നിവ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണങ്ങളിൽ PACT-മെഡിയേറ്റഡ് PKR ആക്റ്റിവേഷൻ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു.പതിറ്റാണ്ടുകളായി, PACT-PKR കാസ്‌കേഡിന്റെ കാൻസർ-നിർദ്ദിഷ്ട നിയന്ത്രണം മനസ്സിലാക്കാനുള്ള ശ്രമങ്ങൾ നടന്നിട്ടുണ്ട്.ഇവിടെ, സെല്ലുലാർ lncRNA DARS-AS1 വഴി ക്യാൻസർ കോശങ്ങളിലെ PACT-PKR നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനുള്ള മറ്റൊരു സംവിധാനം ഞങ്ങളുടെ പഠനം വെളിപ്പെടുത്തി, അത് PACT-മായി നേരിട്ട് ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, PACT-PKR പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്നു, PKR സജീവമാക്കലും eIF2α ഫോസ്ഫോറിലേഷനും തടയുന്നു, അതുവഴി സമ്മർദ്ദം മൂലമുണ്ടാകുന്ന അപ്പോപ്‌ടോസിസും അപ്പോപ്റ്റോസിസും തടയുന്നു. ആത്യന്തികമായി കാൻസർ വ്യാപനത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു.കോശങ്ങൾ.കാൻസർ രോഗനിർണയത്തിനും തെറാപ്പിക്കുമുള്ള സാധ്യതയുള്ള lncRNA ലക്ഷ്യങ്ങളിലേക്ക് ഈ കണ്ടെത്തൽ വെളിച്ചം വീശുന്നു.
ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് PKR, eIF2α എന്നിവയിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവോടെ DARS-AS1 നോക്ക്ഡൗൺ സെറം പട്ടിണിയിലേക്ക് സെല്ലുകളെ സംവേദനക്ഷമമാക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ കാണിച്ചു.ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് PACT/PKR പ്രവർത്തനത്തെ തടഞ്ഞുകൊണ്ട് DARS-AS1 കഠിനമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ കാൻസർ കോശങ്ങളുടെ അതിജീവനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു എന്നാണ്.ASPACT, nc886 എന്നിവ പോലെയുള്ള മറ്റ് നിരവധി നോൺ-കോഡിംഗ് ആർഎൻഎകളും PACT48 mRNA കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെയോ PKR49,50,64 ലേക്ക് ബന്ധിപ്പിച്ച് ഓട്ടോഫോസ്ഫോറിലേഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെയോ PACT/PKR അക്ഷത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.അവയിൽ, DARS-AS1 PACT-PKR അസോസിയേഷന്റെ ഒരു തടസ്സമായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു.ഈ പഠനം PACT/PKR ആക്സിസ് റെഗുലേഷനെക്കുറിച്ചും സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണങ്ങളിൽ lncRNA കളുടെ പങ്കിനെക്കുറിച്ചുമുള്ള നമ്മുടെ ധാരണയെ സമ്പന്നമാക്കുന്നു.
PACT-ൽ മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത ഡൊമെയ്‌നുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.ആദ്യത്തെ രണ്ട് dsRBD-കളിൽ ഓരോന്നും PACT-ന്റെ PKR-ന്റെ ഉയർന്ന അഫിനിറ്റി ബൈൻഡിംഗ് നേടാൻ പര്യാപ്തമാണ്, അതേസമയം മൂന്നാമത്തെ ഡൊമെയ്ൻ (D3) വിട്രോയിലും വിവോയിലും PKR സജീവമാക്കുന്നതിന് ആവശ്യമാണ്.D3 ഡൊമെയ്‌നുമായി DARS-AS1 ഇടപഴകുന്നതായി ഞങ്ങളുടെ പഠനം കാണിച്ചു (ചിത്രം 3h).lncRNA യുടെ (768 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ) വലിയ വലിപ്പം കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, DARS-AS1 D3 യുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് dsRBD, PKR എന്നിവയുടെ PACT ഡൊമെയ്‌നുകൾ തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെ ശാരീരികമായി തടയുകയും അതുവഴി PACT, PKR എന്നിവയുടെ ബന്ധത്തെ തടയുകയും ചെയ്യും.ഡി3യിലെ സെർ246, സെർ287 എന്നിവയെ അലനൈൻ അല്ലെങ്കിൽ അസ്പാർട്ടേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിച്ച PACT പോയിന്റ് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ DARS-AS1-നോടുള്ള അതിന്റെ ബന്ധത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തി, D3 ന്റെ മൊത്തത്തിലുള്ള ഘടനാപരവും വൈദ്യുതവുമായ ഗുണങ്ങളുടെ പ്രാധാന്യത്തെ അവരുടെ അസോസിയേഷനിൽ ചൂണ്ടിക്കാണിക്കുന്നു.കൂടുതൽ കൃത്യമായ ബയോകെമിക്കൽ വിശകലനവും ഉയർന്ന റെസല്യൂഷൻ PACT ഘടനാപരമായ വിശകലനവും ഉപയോഗിച്ച് ഈ സംവിധാനത്തിന്റെ കൂടുതൽ വിശദാംശങ്ങൾ ഭാവിയിൽ ആവശ്യമായി വരും.
DARS-AS1 51,52,53 സംവിധാനങ്ങളിലൂടെ സെൽ വ്യാപനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് മുൻ പഠനങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്.ഒരു ഉദാഹരണത്തിൽ, കിഡ്‌നി കാൻസർ കോശങ്ങളിലെ miP-194-5p ലക്ഷ്യമാക്കി DARS-AS1 അതിന്റെ ആന്റിസെൻസ് പ്രോട്ടീൻ-എൻകോഡിംഗ് DARS ജീനിനെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതായി അന്വേഷകർ നിരീക്ഷിച്ചു.എന്നിരുന്നാലും, നിലവിലെ പഠനത്തിൽ, കുറഞ്ഞത് വൻകുടൽ, സ്തന, കരൾ അർബുദങ്ങൾ ഉൾപ്പെടെ ഒന്നിലധികം തരത്തിലുള്ള ക്യാൻസറുകളിലെ DARS ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനിൽ DARS-AS1 നോക്ക്ഡൗൺ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തിയില്ല.എൽഎൻസിആർഎൻഎകൾ സെൽ, ടിഷ്യു-നിർദ്ദിഷ്ട എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേണുകൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നതിനാൽ, കാൻസർ തരത്തിലുടനീളം പ്രവർത്തന സംവിധാനങ്ങൾ സംരക്ഷിക്കപ്പെടണമെന്നില്ല, ഇത് നമ്മുടെ നിരീക്ഷണങ്ങളും വ്യത്യസ്ത കാൻസറുകളെക്കുറിച്ചുള്ള മുൻകാല വിലയിരുത്തലുകളും തമ്മിലുള്ള ഈ പൊരുത്തക്കേടിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം.വിവിധ ഫിസിയോളജിക്കൽ, പാത്തോളജിക്കൽ പ്രക്രിയകളുടെ പ്രത്യേക സംവിധാനങ്ങൾ വ്യക്തമാക്കുന്നതിന് പ്രത്യേക പഠനങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്.
ട്യൂമറുകളിലെ DARS-AS1 പദപ്രയോഗം കാൻസർ രോഗികളുടെ അതിജീവനവുമായി വിപരീതമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് ക്ലിനിക്കൽ ഡാറ്റയുടെ വിശകലനം കാണിച്ചു, ഇത് ക്യാൻസർ രോഗനിർണയത്തിൽ DARS-AS1/PACT/PKR അക്ഷത്തിന്റെ പ്രാധാന്യം അടിവരയിടുന്നു.ഉപസംഹാരമായി, ഞങ്ങളുടെ പഠനം കാണിക്കുന്നത് DARS-AS1 PACT/PKR സിഗ്നലിംഗ് അച്ചുതണ്ടിന്റെ ഒരു റെഗുലേറ്ററാണ്, ക്യാൻസർ കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു, സമ്മർദ്ദ പ്രതികരണ സമയത്ത് അപ്പോപ്‌ടോസിസിനെ തടയുന്നു, ഇത് മറ്റൊരു ഗവേഷണം നൽകുന്നു, കൂടാതെ ഭാവിയിലെ സാധ്യതയുള്ള ചികിത്സകളെക്കുറിച്ചുള്ള ഗവേഷണത്തിന് താൽപ്പര്യമുണ്ട്. .
ഹ്യൂമൻ സെൽ ലൈനുകൾ SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2, HEK293T എന്നിവ ചൈനയിലെ നാഷണൽ സെൽ ലൈൻ റിസോഴ്‌സ് ഇൻഫ്രാസ്ട്രക്ചറിൽ നിന്നാണ് ലഭിച്ചത്.എല്ലാ സെല്ലുകളും DMEM മീഡിയത്തിൽ (DMEM, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, വാൽതം, MA) 10% FBS (ജെമിനി, ബ്രൂക്ക്ലിൻ, NY) കൂടാതെ 1% പെൻസിലിൻ-സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) 37 ° C, 5% CO2 എന്നിവയിൽ പരിപാലിക്കപ്പെട്ടു.ഇൻകുബേറ്റർ.
ആന്റി-PACT, Abcam (ab31967);ആന്റി-പികെആർ, അബ്കാം (ab184257);ആന്റി-പികെആർ (ഫോസ്ഫോ-ടി451), അബ്കാം (ab81303);ആന്റി-ഫ്ലാഗ്, അബ്കാം (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764) ;വിരുദ്ധ eIF2α (ഫോസ്ഫറസ് S51), Abcam (ab32157);ആന്റി-PACT (ഫോസ്ഫറസ് S246), അബ്ജന്റ് (AP7744b);ആന്റി-β-tubulin, CST (2128);സാധാരണ മൗസ് IgG, CST (5415S);സാധാരണ മുയൽ IgG, CST (2729S).വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗിനായി ആന്റിബോഡികൾ 1:1000 പിബിഎസ്ടിയിലും ഐപിക്ക് 1:100 എന്ന നിലയിലും നേർപ്പിച്ചു.
പൊതുവിൽ ലഭ്യമായ CRISPR-ERA66 എന്ന ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ചാണ് sgRNAകൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തത്.sgRNA ഡെവലപ്‌മെന്റിനായി ഞങ്ങൾ ഡിഫോൾട്ട് ടൂൾ പാരാമീറ്ററുകളും 3 kb റീജിയണിലെ അൽഗോരിതം കമ്പ്യൂട്ട് ചെയ്ത sgRNA ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകളും ഉപയോഗിച്ചു.TSS കേന്ദ്രീകരിച്ച്.sgRNA ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുടെ പൂളുകൾ CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) യിൽ സമന്വയിപ്പിക്കുകയും ഹ്യൂമനിസ്ഡ് pgRNA പ്ലാസ്മിഡുകളിലേക്ക് ക്ലോൺ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു (Addgene #44248).മൊത്തം 12 µg പൂൾ ചെയ്ത ഹ്യൂമനിസ്ഡ് pgRNA പ്ലാസ്മിഡ്, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) എന്നിവ 5 x 1036 സെന്റീമീറ്റർ ഡിഎൻഎയിലേക്ക് 5 x 1036 സെന്റീമീറ്റർ വ്യതിചലനം ഉപയോഗിച്ച് വീണ്ടും സംക്രമണം ചെയ്തു. സെല്ലുകൾ (CWBIO, Beijing, China) നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിക്കുന്നു.കൈമാറ്റം കഴിഞ്ഞ് 48, 72 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞ് വൈറസ് അടങ്ങിയ സൂപ്പർനാറ്റന്റുകൾ ശേഖരിക്കുകയും 0.45 µm ഫിൽട്ടറിലൂടെ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.സ്ക്രീനിംഗിനായി, dCas9/KRAB ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീൻ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന SW620 സെല്ലുകൾ വൈറസ് ട്രാൻസ്ഡക്ഷൻ വഴി ലഭിച്ചു.പരിഷ്കരിച്ച SW620 സെല്ലുകൾ 0.1-0.3 MOI-ൽ നാല് സ്വതന്ത്ര അണുബാധ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ വൈറസ് ലൈബ്രറിയിൽ ബാധിച്ചു, കൂടാതെ 2 ദിവസത്തേക്ക് 2 μg/ml പ്യൂറോമൈസിൻ (സിഗ്മ, സെന്റ്. ലൂയിസ്, MO) സാമ്പിൾ ചെയ്തു.അതിനുശേഷം, സ്‌ക്രീനിംഗിനായി 500 സെല്ലുകൾ/എസ്‌ജിആർഎൻഎയുടെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ ലൈബ്രറി കവറേജുള്ള സെല്ലുകൾ 18 ദിവസത്തേക്ക് വിട്രോയിൽ സംസ്‌കരിച്ചു.
QIAamp DNA ബ്ലഡ് മിഡി കിറ്റിന്റെ (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183) നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായാണ് ജീനോമിക് DNA വേർതിരിച്ചെടുത്തത്.മൊത്തത്തിൽ, ഒരു ബയോളജിക്കൽ ആവർത്തനത്തിന് 100 μg ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ ലൈബ്രറി നിർമ്മിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു.sgRNA മേഖല രണ്ട് റൗണ്ട് പിസിആർ ഉപയോഗിച്ച് വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ഒരു ബാർകോഡുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.
NucleoSpin® gel, PCR പ്യൂരിഫിക്കേഷൻ കിറ്റ് (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ശുദ്ധീകരിക്കുകയും Qubit™ HS ഡബിൾ സ്‌ട്രാൻഡഡ് DNA ഡിറ്റക്ഷൻ കിറ്റ് (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്; Q32854) ഉപയോഗിച്ച് അളക്കുകയും ചെയ്തു.
കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനം അളക്കാൻ MTS വിശകലനം ഉപയോഗിച്ചു.2000 സെല്ലുകൾ/കിണർ എന്ന പ്രാരംഭ സാന്ദ്രതയിൽ 96-കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ കോശങ്ങൾ വിത്ത് പാകി.മൊത്തം 4-6 ദിവസത്തേക്ക് സൂചിപ്പിച്ച സമയത്ത് സെല്ലുകളുടെ ആപേക്ഷിക എണ്ണം ദിവസവും അളക്കുന്നു.ഓരോ കിണറിനും, 20 μl MTS റീജന്റ് (പ്രൊമേഗ) 100 μl DMEM ഉപയോഗിച്ച് ലയിപ്പിച്ചു, 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 4 മണിക്കൂർ സെല്ലുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് OD490 അളക്കുന്നു.
ഗോളങ്ങളുടെ രൂപീകരണം വിശകലനം ചെയ്താണ് ആങ്കർ ചെയ്യാത്ത വളർച്ചയ്ക്കുള്ള ശേഷി കണ്ടെത്തിയത്.ചുരുക്കത്തിൽ, shRNA DARS-AS1 അല്ലെങ്കിൽ കൺട്രോൾ shRNA ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ട 2000 സെല്ലുകൾ ഓരോ 4 ദിവസത്തിലും ഇടത്തരം മാറ്റങ്ങളോടെ അൾട്രാ ലോ അറ്റാച്ച്‌മെന്റ് മൈക്രോപ്ലേറ്റുകളിൽ (കോർണിംഗ്) സംസ്ക്കരിച്ചു.14 ദിവസത്തിന് ശേഷം ഗോളാകൃതികൾ കണക്കാക്കി.DARS-AS1 ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ പ്ലാസ്മിഡ് അല്ലെങ്കിൽ കൺട്രോൾ പ്ലാസ്മിഡ് ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ട 500 സെല്ലുകൾ മെച്ചപ്പെടുത്തൽ വിലയിരുത്തലിനായി ഉപയോഗിച്ചു, അല്ലാത്തപക്ഷം രീതി മാറ്റമില്ല.
Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് T7 RNA പോളിമറേസ്, ബയോട്ടിൻ-16-UTP (Roche 1138908910) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ആർഎൻഎ ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്തു.ഇവിടെ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രൈമറുകൾ സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 4-ൽ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു.
പ്രോട്ടീൻ-കോഡിംഗ് PACT അല്ലെങ്കിൽ PKR മേഖലകൾ pET15b (Addgene #73619) ആയി ക്ലോൺ ചെയ്യുകയും BL21(DE3) ആയി രൂപാന്തരപ്പെടുകയും ചെയ്തു.ആംപിസിലിൻ നൽകിയ എൽബിയിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ബാക്ടീരിയകൾ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും പുതിയ എൽബി ഉപയോഗിച്ച് 100 മടങ്ങ് നേർപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.മീഡിയത്തിന്റെ OD600 0.8ൽ എത്തിയപ്പോൾ, പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ പ്രേരിപ്പിക്കാൻ 1 mM IPTG ചേർത്തു.സൗമ്യമായ കുലുക്കത്തോടെ (20°C-ൽ 250 ആർപിഎം) ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഇൻകുബേഷനുശേഷം, സെൽ പെല്ലറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ (4000 ആർപിഎം, 10 മിനിറ്റ്, 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ്) വഴി ശേഖരിച്ചു.ലിസിസ് ബഫറിൽ സെൽ പെല്ലറ്റ് വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുക (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ഐസിൽ 30 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് സോണികേറ്റ് ചെയ്യുക (15 മിനിറ്റ്, 5 സെ ഓൺ/ഓഫ്, ഐസ്), സെൻട്രിഫ്യൂജ് (13,000) ആർപിഎം)., 30 മിനിറ്റ്, 4 ° С).സൂപ്പർനാറ്റന്റ് Ni-NTA റെസിനിൽ (QIAGEN) 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 3 തവണ കയറ്റി, വാഷ് ബഫർ (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM ഇമിഡാസോൾ, 250 mM NaCl) ഉപയോഗിച്ച് 4 തവണ കഴുകി, 3 പ്രാവശ്യം എൽയൂട്ട് ചെയ്തു. 10 മില്ലി എല്യൂന്റ് ബഫറിന്റെ (50 എംഎം ട്രൈസ്, പിഎച്ച് 8.0, 250 എംഎം നാസിഎൽ, 300 എംഎം ഇമിഡാസോൾ).WB ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിച്ച പ്രോട്ടീൻ നിർണ്ണയിച്ചു, Qubit™ പ്രോട്ടീൻ അസ്സെ കിറ്റ് (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്; Q 33212) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഏകാഗ്രത നിർണ്ണയിക്കുന്നത്.
പരിഷ്‌ക്കരണങ്ങളോടെ മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ RIP പരിശോധനകൾ നടത്തി.ചുരുക്കത്തിൽ, 1x RIP ബഫർ (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (ബിയോടൈം ബയോടെക്‌നോളജി), 1 mM DDM, കോടെയ്ൽ 1 പ്രോട്ടെയ്‌സ് 01 പ്രോട്ടെയ്‌സ്) (റോച്ചെ, 1 എംഎം ഡിടിടി) കൂടാതെ 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 15 മിനിറ്റ് 13,000 ആർപിഎമ്മിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജും.5 μg ആന്റി-PACT ആന്റിബോഡി (Abeam) അല്ലെങ്കിൽ IgG (CST) എന്നിവയുമായി സംയോജിപ്പിച്ച പ്രോട്ടീൻ A+G കാന്തിക മുത്തുകൾ (മില്ലിപോർ) ഉപയോഗിച്ച് സൂപ്പർനാറ്റന്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.മുത്തുകൾ 5x RIP ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 5 തവണ കഴുകി, തുടർന്ന് പ്രോട്ടീനേസ് കെ (NEB) ഉപയോഗിച്ച് ദഹിപ്പിക്കപ്പെട്ടു.ട്രൈസോൾ ഉപയോഗിച്ച് ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും RT-qPCR നിർണ്ണയിക്കുകയും ചെയ്തു.പ്രൈമറുകൾ സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 5-ൽ അവതരിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.
പരിഷ്‌ക്കരിച്ച സ്റ്റാൻഡേർഡ് RIP അസ്സേ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ചാണ് ഇൻ വിട്രോ RIP പരിശോധന നടത്തിയത്.ഇൻ വിട്രോ ട്രാൻസ്‌ക്രൈബുചെയ്‌ത ആർഎൻഎയുടെ മൊത്തം 5 പിഎംഎൽ RIP ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 1x നേർപ്പിച്ച് 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 5 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേഷൻ വഴി അനീൽ ചെയ്തു, തുടർന്ന് മുറിയിലെ താപനിലയിലേക്ക് സാവധാനം തണുപ്പിക്കുന്നു.മൊത്തം 5 പിഎംഎൽ കേടുകൂടാത്തതോ മ്യൂട്ടേറ്റഡ് ഫ്ലാഗ് ലേബൽ ചെയ്തതോ ആയ PACT പ്രോട്ടീനുകൾ E. coli ൽ നിന്ന് ശുദ്ധീകരിച്ചു.4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 2 മണിക്കൂർ പുനർനിർമ്മിച്ച ആർഎൻഎ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, ആന്റി-ഫ്ലാഗ് ഐപിയ്‌ക്കായി RIP വിശകലനത്തിനായി മുകളിൽ പറഞ്ഞ നടപടിക്രമം പിന്തുടരുക.
RNA വിപുലീകരണ വിശകലനത്തിനായി, 1xRIP ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 1×107 സെല്ലുകൾ ലൈസ് ചെയ്തു.4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 15 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 13,000 ആർപിഎമ്മിൽ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷനുശേഷം, സൂപ്പർനാറ്റന്റ് 30 μl സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ കാന്തിക മുത്തുകൾ (ബെക്ക്മാൻ) ഉപയോഗിച്ച് 2 മണിക്കൂർ 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്തു.ശുദ്ധീകരിച്ച ലൈസേറ്റ് പിന്നീട് യീസ്റ്റ് ടിആർഎൻഎ നൽകുകയും 40 പിഎംഎൽ പുനർനിർമ്മിച്ച ആർഎൻഎ ഉപയോഗിച്ച് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും പിന്നീട് 2 മണിക്കൂർ നേരം ബിഎസ്എയിൽ തടഞ്ഞുവച്ച 20 μl പുതിയ സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ കാന്തിക മുത്തുകൾ ചേർക്കുകയും ചെയ്തു.വാഷിംഗ് സ്റ്റെപ്പ് 5x RIP ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 4 തവണയും 1x RIP ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 4 തവണയും ഉൾക്കൊള്ളുന്നു.അനുബന്ധ പ്രോട്ടീനുകൾ ബയോട്ടിൻ എല്യൂഷൻ ബഫർ (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) ഉപയോഗിച്ച് എലൂറ്റ് ചെയ്യുകയും NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen)-ൽ വേർതിരിക്കുകയും ചെയ്തു.സിൽവർ സ്റ്റെയിനിംഗിന് ശേഷം (ബിയോടൈം ബയോടെക്നോളജി), ചില ബാൻഡുകൾ എക്സൈസ് ചെയ്യുകയും വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
PACT ഉം PKR ഉം തമ്മിലുള്ള ഇടപെടൽ പരിശോധിക്കുന്നതിനായി കോ-ഐപി വിശകലനം നടത്തി.ചുരുക്കത്തിൽ, 1 x 107 ലൈസ്ഡ് സെല്ലുകൾ 1 x RIP ബഫറിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്‌ത് സൂപ്പർനാറ്റന്റ് ലൈസേറ്റ് തയ്യാറാക്കി, തുടർന്ന് 13,000 ആർപിഎമ്മിൽ 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 15 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ നടത്തി.ലൈസേറ്റുകളിൽ പ്രോട്ടീൻ A + G കാന്തിക മുത്തുകൾ കയറ്റി, 5 µg ആന്റി-PACT ആന്റിബോഡിയുമായി സംയോജിപ്പിച്ച്, 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് സൌമ്യമായി ഭ്രമണം ചെയ്തു.മുത്തുകൾ 5×RIP ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകി, 1×RIP ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് രണ്ട് തവണ കഴുകി, 1×SDS ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് എല്യൂട്ടുചെയ്തു.വീണ്ടെടുക്കപ്പെട്ട പ്രോട്ടീൻ SDS-PAGE ജെൽ വിശകലനം ചെയ്യുകയും WB കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്തു.
ഫ്ലാഗുചെയ്‌ത PACT-ന്റെ രണ്ട് pmol ഉം PKR-ന്റെ 1 pmol ഉം E. coli-ൽ നിന്ന് ശുദ്ധീകരിച്ചു.1× RIP ബഫറിൽ നേർപ്പിച്ച്, 4 °C താപനിലയിൽ 2 മണിക്കൂർ നേരം 10 pmol RNA ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.അതിനുശേഷം, പ്രോട്ടീൻ എ+ജി മാഗ്നറ്റിക് ബീഡ്-കോൺജഗേറ്റഡ് ആന്റി-ലേബൽഡ് ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് രണ്ട് മണിക്കൂർ കൂടി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.മുത്തുകൾ 1x RIP ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് നാല് തവണ കഴുകുകയും 1x SDS ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് എല്യൂട്ടുചെയ്യുകയും ചെയ്തു.തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന PACT, PKR എന്നിവ WB കണ്ടെത്തി.